हटस्टार्ट Taq DNA पोलिमरेज
हट स्टार्ट टाक डीएनए पोलिमरेज (एन्टिबडी परिमार्जन) थर्मस एक्वाटिकस YT-1 बाट हट-स्टार्ट थर्मोस्टेबल डीएनए पोलिमरेज हो, जसमा 5′→3′ पोलिमरेज गतिविधि र 5' फ्ल्याप एन्डोन्यूक्लिज गतिविधि हुन्छ।हट-स्टार्ट Taq DNA पोलिमरेज एक Taq DNA पोलिमरेज हो जुन थर्मोलाबिल Taq एन्टिबडीहरू द्वारा परिमार्जन गरिएको हो।एन्टिबडी परिमार्जनले PCR को विशिष्टता, संवेदनशीलता र उपज बढ्यो।
अवयवहरू
| कम्पोनेन्ट | HC1012A-०१ | HC1012A-०२ | HC1012A-०३ | HC1012A-04 |
| 5×HC Taq बफर | ४×१ एमएल | ४×१० एमएल | 4×50 एमएल | ५×४०० एमएल |
| हट स्टार्ट Taq DNA पोलिमरेज (एन्टिबडी परिमार्जित) (5 U/μL) | ०.१ एमएल | १ एमएल | ५ एमएल | १० × ५ एमएल |
अनुप्रयोगहरू
10 mM Tris-HCl (pH 7.4 at 25℃), 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, 0.5% Tween20, 0.5% IGEPALCA-630 र 50% Glycerol।
भण्डारण अवस्था
ढुवानी 0°C अन्तर्गत र -25°C~-15°C मा भण्डारण गर्नुहोस्।
एकाइ परिभाषा
एक एकाइलाई 75 डिग्री सेल्सियसमा 30 मिनेटमा एसिड अघुलनशील पदार्थमा 15 एनएमओएल डीएनटीपी समावेश गर्ने इन्जाइमको मात्राको रूपमा परिभाषित गरिएको छ।
गुणस्तर नियन्त्रण
1.Endonuclease गतिविधि:4 μg pUC19 DNA सँग 37 ℃ मा 4 घण्टासम्म इन्जाइमको 20 U को इन्क्युबेशनले जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा निर्धारण गरे अनुसार DNA को कुनै पत्ता लगाउन सकिने ह्रास भएन।
2.5 kb Lambda PCR:200 µM dNTPs र 0.2 µM प्राइमरको उपस्थितिमा Taq DNA पोलिमरेजको 1.25 इकाइहरू सहित 5 ng Lambda DNA को PCR एम्प्लीफिकेशनको 25 चक्रहरूले अपेक्षित 5 kb उत्पादनमा परिणाम दिन्छ।
3.Exonuclease गतिविधि:10 nmol 5´-FAM ओलिगोन्युक्लियोटाइड सहित न्यूनतम १२.५ U Taq DNA पोलिमरेज भएको 50 μl प्रतिक्रियाको इन्क्युबेशनले 37 ℃ मा 30 मिनेटको लागि कुनै पत्ता लगाउन सकिने ह्रास उत्पन्न गर्दैन।
4.RNase गतिविधि:37°C मा 2 घण्टाको लागि 1μg RNA ट्रान्सक्रिप्टको साथ 20 U इन्जाइम भएको 10 μL प्रतिक्रियाको इन्क्युबेशनले जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा निर्धारण गरे अनुसार RNA को कुनै पत्ता लगाउन सकिने ह्रास भएन।
5.गर्मी निष्क्रियता:छैन।
प्रतिक्रिया प्रणाली
| अवयवहरू | भोल्युम |
| टेम्प्लेट डीएनएa | वैकल्पिक |
| 10 μM फर्वार्ड प्राइमर | ०.५ μL |
| 10 μM रिभर्स प्राइमर | ०.५ μL |
| dNTP मिक्स (10mm प्रत्येक) | ०.५ μL |
| 5×HC Taq बफर | ५ μL |
| Taq DNA पोलिमरेजb(5U/μL) | ०.१२५ μL |
| न्यूक्लिज-मुक्त पानी | 25 μL सम्म |
नोट:
१) क.
| DNA | रकम |
| जीनोमिक | 1 ng-1 μg |
| प्लाज्मिड वा भाइरल | 1 pg-1 ng |
२) ख।Taq DNA Polymerase को इष्टतम एकाग्रता विशेष अनुप्रयोगहरूमा 5-50 एकाइ/mL (0.1-0.5 एकाइहरू/25 μL प्रतिक्रिया) बाट दायरा हुन सक्छ।
थर्मल साइकल चलाउने प्रोटोकल
PCR
| चरण | तापक्रम(°C) | समय | साइकलहरू |
| प्रारम्भिक विकृतीकरणa | 95 ℃ | 1-3 मिनेट | - |
| विकृतीकरण | 95 ℃ | १५-३० सेकेन्ड | 30-35 साइकल |
| एनिलिङb | 45-68 ℃ | १५-६० सेकेन्ड | |
| विस्तार | 68 ℃ | 1kb/मिनेट | |
| अन्तिम विस्तार | 68 ℃ | ५ मिनेट | - |
नोट:
1) 95°C मा 1 मिनेट को प्रारम्भिक विकृतीकरण धेरै प्रवर्द्धन को लागी पर्याप्त छ।कठिन टेम्प्लेटहरूको लागि, 95 डिग्री सेल्सियसमा 2-3 मिनेटको लामो विकृतीकरण सिफारिस गरिन्छ।कोलोनी पीसीआरको साथ, प्रारम्भिक 5 मिनेट 95 डिग्री सेल्सियसमा विकृतीकरण सिफारिस गरिन्छ।
2) annealing चरण सामान्यतया 15-60 s छ।एनिलिङ तापक्रम प्राइमर जोडीको Tm मा आधारित हुन्छ र सामान्यतया 45-68℃ हुन्छ।
