Rnase अवरोधक
Murine RNase अवरोधक एक पुन: संयोजक murine RNase अवरोधक व्यक्त र E.coli बाट शुद्ध छ।यो RNase A, B वा C सँग 1: 1 अनुपातमा गैर-सहसंयोजक बन्धन मार्फत बाँध्छ, जसले गर्दा तीन इन्जाइमहरूको गतिविधिलाई रोक्छ र RNA लाई गिरावटबाट बचाउँछ।यद्यपि, यो Aspergillus बाट RNase 1, RNase T1, S1 Nuclease, RNase H वा RNase विरुद्ध प्रभावकारी छैन।Murine RNase अवरोधक RT-PCR, RT-qPCR र IVT mRNA द्वारा परीक्षण गरिएको थियो, र विभिन्न व्यावसायिक रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेस, डीएनए पोलिमेरासेस र आरएनए पोलिमरेजहरूसँग उपयुक्त थियो।
मानव RNase अवरोधकहरूको तुलनामा, murine RNase अवरोधकले दुई सिस्टिनहरू समावेश गर्दैन जुन अक्सीकरणको लागि अत्यधिक संवेदनशील हुन्छ जसले अवरोधकको निष्क्रियता निम्त्याउँछ।यसले यसलाई DTT को कम सांद्रता (1 mM भन्दा कम) मा स्थिर बनाउँछ।यो सुविधाले यसलाई प्रतिक्रियाहरूमा प्रयोगको लागि उपयुक्त बनाउँछ जहाँ DTT को उच्च सांद्रता प्रतिक्रियाको लागि प्रतिकूल हुन्छ (जस्तै वास्तविक-समय RT-PCR)।
Aआवेदन
यो उत्पादन कुनै पनि प्रयोगमा व्यापक रूपमा प्रयोग गर्न सकिन्छ जहाँ RNase हस्तक्षेपबाट बच्न सम्भव छ, जस्तै:
1.cDNA, RT-PCR, RT-qPCR, आदि को पहिलो स्ट्र्यान्डको संश्लेषण।
2.इन भिट्रो ट्रान्सक्रिप्शन/अनुवाद (जस्तै, भिट्रो भाइरल प्रतिकृति प्रणालीमा) को समयमा गिरावटबाट आरएनएलाई बचाउँछ।
3.आरएनए विभाजन र शुद्धीकरण को समयमा RNase गतिविधि को अवरोध।
भण्डारण सर्तहरू
उत्पादन -25～-15 ℃ मा भण्डारण गर्न सकिन्छ, 2 वर्षको लागि मान्य।
भण्डारण बफर
50 एमएम केसीएल, 20 एमएम हेपस-कोह (पीएच 7.6, 25 डिग्री सेल्सियस), 8 एमएम डीटीटी र 50% ग्लिसरोल।
एकाइ परिभाषा
5ng ribonuclease A को 50% को गतिविधिलाई रोक्न आवश्यक murine RNase अवरोधक को मात्रा एक एकाइ (U) को रूपमा परिभाषित गरिएको थियो।
प्रोटीन को आणविक वजन
murine RNase अवरोधक को आणविक वजन 50 kDa छ।
गुणस्तर नियन्त्रण
Exonuclease गतिविधि:
1 μg λ -Hind III डाइजेस्ट DNA 37 ℃ मा 16 घण्टाको लागि 40 U को murine RNase inhibitor ले agarose जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा निर्धारण गरे अनुसार कुनै गिरावट उत्पन्न गर्दैन।
Endonuclease गतिविधि:
1μg λ DNA को साथ 1μg λ DNA को 40 U को 37 ℃ मा 16 घण्टाको लागि एगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा निर्धारण गरे अनुसार कुनै गिरावट उत्पन्न गर्दैन।
निकिङ गतिविधि:
1μg pBR322 को साथ 1μg pBR322 को 40U को 37 ℃ मा 16 घण्टाको लागि एगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा निर्धारण गरे अनुसार कुनै गिरावट उत्पन्न गर्दैन।
RNase गतिविधि:
1.6μg MS2 RNA को साथ 40U को murine RNase inhibitor 4h को लागि 37℃ मा एगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा निर्धारण गरिए अनुसार कुनै गिरावट उत्पन्न गर्दैन।
E.कोलाई डीएनए:
E. coli 16S rRNA लोकसका लागि विशेष प्राइमरहरू सहित TaqMan qPCR प्रयोग गरी E. coli genomic DNA को उपस्थितिको लागि 40 U को murine RNase अवरोधकको जाँच गरिन्छ।ई. कोलाई जीनोमिक DNA संदूषण ≤ ०.१ pg/40 U हो।
Notes
1. हिंसक दोलन वा हलचल इन्जाइम निष्क्रियता निम्त्याउँछ।
2. यो अवरोधक को अधिकतम तापमान दायरा 25-55 ℃ थियो, र यो 65 ℃ र माथि मा निष्क्रिय थियो।
3. RNase H, RNase 1 र RNase T1 को गतिविधिहरू murine RNase अवरोधक द्वारा निषेध गरिएको थिएन।
4. RNase गतिविधि को अवरोध pH को एक विस्तृत दायरामा फेला पर्यो (pH 5-9 सबै सक्रिय थिए), र उच्चतम गतिविधि pH 7-8 मा अवलोकन गरिएको थियो।
5. रिबोन्युक्लीजहरूले सामान्यतया डिनेचरिङ परिस्थितिहरूमा गतिविधि कायम राखेको हुनाले, रिबोन्यूक्लिजसँग जटिल भएका RNase इनहिबिटर अणुहरूलाई डिनेचर गर्नबाट बच्न सावधानी अपनाउनु पर्छ।सक्रिय रिबोन्यूक्लिजको रिलीजलाई रोक्नको लागि, 50 डिग्री सेल्सियस भन्दा माथिको तापक्रम र यूरिया वा अन्य घटाउने एजेन्टहरूको उच्च सांद्रताबाट बच्नुपर्छ।
