प्रोटिनेज K mNGS (तरल)
Proteinase K व्यापक सब्सट्रेट विशिष्टताको साथ एक स्थिर सेरीन प्रोटीज हो।यसले डिटर्जेन्टको उपस्थितिमा पनि नेटिभ स्टेटमा धेरै प्रोटीनहरू घटाउँछ।क्रिस्टल र आणविक संरचना अध्ययनबाट प्रमाणले संकेत गर्दछ कि इन्जाइम सक्रिय साइट उत्प्रेरक ट्रायड (एएसपी) को साथ सबटिलिसिन परिवारसँग सम्बन्धित छ।39- उनको69- सेर२२४)।क्लीभेजको प्रमुख साइट एलीफेटिक र एरोमेटिक एमिनो एसिडको कार्बोक्साइल समूहसँग जोडिएको पेप्टाइड बन्ड हो जसमा अवरुद्ध अल्फा एमिनो समूहहरू छन्।यो सामान्यतया यसको व्यापक विशिष्टता को लागी प्रयोग गरिन्छ।यो प्रोटीनेज K विशेष रूपमा mNGS को लागि डिजाइन गरिएको हो।अन्य प्रोटीनेज K को तुलनामा, यसले एउटै इन्जाइम्याटिक प्रदर्शनको साथ अझ कम न्यूक्लिक एसिड प्रदूषण समावेश गर्दछ, जसले डाउनस्ट्रीम mNGS अनुप्रयोगलाई अझ राम्रो सुनिश्चित गर्न सक्छ।
भण्डारण सर्तहरू
2-8 ℃ 2 वर्षको लागि
निर्दिष्टीकरण
| उपस्थिति | रंगहीन देखि हल्का खैरो तरल |
| गतिविधि | ≥800 U/ml |
| प्रोटिन एकाग्रता | ≥20 mg/ml |
| निकसे | कुनै पनि पत्ता लागेन |
| DNase | कुनै पनि पत्ता लागेन |
| RNase | कुनै पनि पत्ता लागेन |
गुणहरू
| EC नम्बर | ३.४.२१.६४(ट्रिटिराचियम एल्बमबाट पुनः संयोजक) |
| आइसोइलेक्ट्रिक बिन्दु | ७.८१ |
| इष्टतम pH | ७.०- १२.० चित्र १ |
| इष्टतम तापमान | ६५ ℃ चित्र २ |
| pH स्थिरता | pH 4.5- 12.5 (25 ℃, 16 h) चित्र 3 |
| थर्मल स्थिरता | ५० ℃ तल (pH ८.०, ३० मिनेट) चित्र ४ |
| भण्डारण स्थिरता | 25 ℃ मा 12 महिनाको लागि 90% भन्दा बढी गतिविधि |
| सक्रियकर्ताहरू | एसडीएस, यूरिया |
| अवरोधकहरू | डाइसोप्रोपाइल फ्लोरोफोस्फेट;phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड |
अनुप्रयोगहरू
1. जेनेटिक डायग्नोस्टिक किट
2. RNA र DNA निकासी किटहरू
3. तन्तुहरूबाट गैर-प्रोटीन घटकहरू निकासी, प्रोटिन अशुद्धताहरूको ह्रास, जस्तै DNAखोप र हेपरिन को तयारी
4. स्पंदित इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा क्रोमोजोम DNA को तयारी
5. पश्चिमी धब्बा
6. इन्जाइमेटिक ग्लाइकोसिलेटेड एल्बुमिन अभिकर्मक इन भिट्रो डायग्नोसिस
सावधानी
प्रयोग गर्दा वा तौल गर्दा सुरक्षात्मक पन्जा र चश्मा लगाउनुहोस्, र प्रयोग पछि राम्रो हावामा राख्नुहोस्।यो उत्पादन छाला एलर्जी प्रतिक्रिया र गम्भीर आँखा जलन हुन सक्छ।यदि सास लिने हो भने, यसले एलर्जी वा दमको लक्षण वा डिस्पनिया हुन सक्छ।श्वासप्रश्वासमा समस्या आउन सक्छ।
एकाइ परिभाषा
एक एकाइ (U) लाई 1 μmol उत्पादन गर्न केसिन हाइड्रोलाइज गर्न आवश्यक इन्जाइमको मात्राको रूपमा परिभाषित गरिएको छ।निम्न सर्तहरूमा tyrosine प्रति मिनेट।
अभिकर्मक तयारी
अभिकर्मक I: 1g दूध केसिन 0.1M सोडियम फस्फेट घोल (pH 8.0) को 50ml मा भंग गरियो, 65-70 ℃ पानीमा 15 मिनेटको लागि इन्क्युबेटेड, हलचल र घुलनशील, पानी द्वारा चिसो, सोडियम हाइड्रोक्साइड द्वारा pH 8.0 मा समायोजित, र फिक्स भोल्युम। 100ml
अभिकर्मक II: 0.1M ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड, 0.2M सोडियम एसीटेट, 0.3M एसिटिक एसिड।
अभिकर्मक III: 0.4M Na2CO3समाधान।
अभिकर्मक IV: फोरिन्ट अभिकर्मक 5 पटक शुद्ध पानी संग पातलो।
अभिकर्मक V: इन्जाइम पातलो: 0.1M सोडियम फास्फेट समाधान (pH 8.0)।
अभिकर्मक VI: tyrosine समाधान: 0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol/ml tyrosine 0.2 सँग घुलनशीलएम एचसीएल।
प्रक्रिया
1. 0.5ml अभिकर्मक I लाई पहिले नै 37℃ मा न्यानो पारिएको छ, 0.5ml इन्जाइमको घोल थप्नुहोस्, राम्ररी मिलाउनुहोस्, र इन्क्युबेट गर्नुहोस्।10 मिनेटको लागि 37 ℃।
2. प्रतिक्रिया रोक्न 1ml अभिकर्मक II थप्नुहोस्, राम्ररी मिलाउनुहोस्, र 30 मिनेटको लागि इन्क्युबेशन जारी राख्नुहोस्।
3. Centrifugate प्रतिक्रिया समाधान।
४. ०.५ एमएल सुपरनेटेन्ट लिनुहोस्, २.५ एमएल अभिकर्मक III, ०.५ एमएल अभिकर्मक IV थप्नुहोस्, राम्ररी मिलाउनुहोस् र ३७ डिग्री सेल्सियसमा इन्क्युबेट गर्नुहोस्।30 मिनेट को लागी।
5. OD६६०OD को रूपमा निर्धारण गरिएको थियो1;खाली नियन्त्रण समूह: 0.5ml अभिकर्मक V इन्जाइम प्रतिस्थापन गर्न प्रयोग गरिन्छOD निर्धारण गर्न समाधान६६०OD को रूपमा2, ΔOD=OD1-ओडी2.
6. L-tyrosine मानक वक्र: 0.5mL विभिन्न एकाग्रता L-tyrosine समाधान, 2.5mL अभिकर्मक III, 0.5mL अभिकर्मक IV 5mL सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबमा, 37 ℃ मा 30 मिनेटको लागि इन्क्युबेट गर्नुहोस्, OD को लागि पत्ता लगाउनुहोस्६६०L-tyrosine को विभिन्न एकाग्रताको लागि, त्यसपछि मानक वक्र Y=kX+b प्राप्त गरियो, जहाँ Y L-tyrosine एकाग्रता हो, X OD हो।६००.
गणना
२: प्रतिक्रिया समाधानको कुल मात्रा (mL)
०.५: इन्जाइम समाधानको मात्रा (एमएल)
0.5: क्रोमोजेनिक निर्धारण (mL) मा प्रयोग हुने प्रतिक्रिया तरल मात्रा
10: प्रतिक्रिया समय (मिनेट)
Df: मल्टिपल डिल्युसन
C: इन्जाइम एकाग्रता (mg/mL)
सन्दर्भहरू
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett।(1972);२३:७७।
2. Wieger U & Hilz H. बायोकेम।बायोफिज।Res.कम्युन।(1971);४४:५१३।
3. हिल्ज, एच।et al.,युरो।जे बायोकेम।(1975);५६:१०३–१०८।
4. सम्ब्रुक जेet al., आणविक क्लोनिंग: एक प्रयोगशाला म्यानुअल, दोस्रो संस्करण, कोल्ड स्प्रिंग हार्बरप्रयोगशाला प्रेस, कोल्ड स्प्रिंग हार्बर (1989)।
तथ्याङ्कहरू
फिग.1 इष्टतम pH
100mm बफर समाधान: pH6.0-8.0, Na-phosphate;pH8.0-9.0, Tris-HCl;pH9.0-12.5, Glycine-NaOH. इन्जाइम एकाग्रता: 1mg/mL
Fig.2 इष्टतम तापमान
20 मिमी K-फस्फेट बफर pH 8.0 मा प्रतिक्रिया।इन्जाइम एकाग्रता: 1 मिलीग्राम / एमएल
Fig.3 pH स्थिरता
25 ℃, 50 mM बफर समाधान संग 16 h-उपचार: pH 4.5- 5.5, एसीटेट;pH 6.0-8.0, Na-phosphate;pH 8.0-9.0, Tris-HClpH 9.0- 12.5, Glycine-NaOH।इन्जाइम एकाग्रता: 1 मिलीग्राम / एमएल
Fig.4 थर्मल स्थिरता
५० एमएम ट्रिस-एचसीएल बफर, पीएच ८.० सँग ३० मिनेट-उपचार।इन्जाइम एकाग्रता: 1 मिलीग्राम / एमएल
Fig.5 भण्डारण स्थिरताty at २५ ℃
