प्रोटिनेज के एनजीएस (पाउडर)
बिरालो नम्बर: HC4507A
NGS Protease K उच्च इन्जाइम गतिविधि र फराकिलो सब्सट्रेट विशिष्टताको साथ एक स्थिर सेरीन प्रोटीज हो। इन्जाइमले प्राथमिकतामा हाइड्रोफोबिक एमिनो एसिड, सल्फर युक्त एमिनो एसिड र सुगन्धित एमिनो एसिडको सी-टर्मिनलको छेउमा एस्टर बन्डहरू र पेप्टाइड बन्डहरूलाई विघटन गर्छ।त्यसोभए, यो प्रायः प्रोटिनहरूलाई छोटो पेप्टाइडहरूमा घटाउन प्रयोग गरिन्छ।एनजीएस प्रोटीज के एएसपीको साथ एक विशिष्ट सेरिन प्रोटीज हो39- उनको69- सेर२२४उत्प्रेरक ट्रायड जो सेरिन प्रोटीजहरूको लागि अद्वितीय छ, र उत्प्रेरक केन्द्र टो Ca द्वारा घेरिएको छ।2+स्थिरीकरणको लागि बाध्यकारी साइटहरू, सर्तहरूको फराकिलो दायरा अन्तर्गत उच्च इन्जाइम गतिविधि कायम राख्न।
निर्दिष्टीकरण
| उपस्थिति | सेतो देखि अफ-सेतो अमोर्फस पाउडर, lyophilized |
| विशिष्ट गतिविधि | ≥40U/mg ठोस |
| DNase | कुनै पनि पत्ता लागेन |
| RNase | कुनै पनि पत्ता लागेन |
| बायोबर्डन | ≤50CFU/g ठोस |
| न्यूक्लिक एसिड अवशेष | <5pg/mg ठोस |
गुणहरू
| मुहान | Tritirachium एल्बम |
| EC नम्बर | ३.४.२१.६४(ट्रिटिराचियम एल्बमबाट पुनः संयोजक) |
| आणविक वजन | 29kDa (SDS-PAGE) |
| आइसोइलेक्ट्रिक बिन्दु | ७.८१ चित्र १ |
| इष्टतम pH | 7.0-12.0 (सबैले उच्च गतिविधि प्रदर्शन गर्दछ) चित्र.2 |
| इष्टतम तापमान | 65℃ चित्र।3 |
| pH स्थिरता | pH 4.5-12.5 (25℃,16h) चित्र।4 |
| थर्मल स्थिरता | ५० ℃ तल (pH 8.0, 30min) Fig.5 |
| भण्डारण स्थिरता | 12 महिनाको लागि 25℃ मा भण्डारण गरिएको छ |
| सक्रियकर्ताहरू | एसडीएस, यूरिया |
| अवरोधकहरू | डाइसोप्रोपाइल फ्लोरोफोस्फेट;benzylsulfonyl फ्लोराइड |
भण्डारण सर्तहरू
lyophilized पाउडर -25~-15 ℃ मा लामो समय को लागी प्रकाश देखि टाढा भण्डारण गर्नुहोस्;विघटन पछि, प्रकाशबाट टाढा 2-8 ℃ मा छोटो-अवधि भण्डारणको लागि उपयुक्त भोल्युममा वा लामो-अवधि भण्डारण -25~-15 ℃ प्रकाशबाट टाढा।
सावधानी
प्रयोग गर्दा वा तौल गर्दा सुरक्षात्मक पन्जा र चश्मा लगाउनुहोस्, र प्रयोग पछि राम्रो हावामा राख्नुहोस्।यो उत्पादन छाला एलर्जी प्रतिक्रिया र गम्भीर आँखा जलन हुन सक्छ।यदि सास लिने हो भने, यसले एलर्जी वा दमको लक्षण वा डिस्पनिया हुन सक्छ।श्वासप्रश्वासमा समस्या आउन सक्छ।
एकाइ परिभाषा
NGS Protease K को एक एकाइलाई मानक निर्धारण अवस्थाहरूमा 1 μmol L-tyrosine मा केसिनलाई हाइड्रोलाइज गर्न आवश्यक इन्जाइमको मात्राको रूपमा परिभाषित गरिएको छ।
अभिकर्मक तयारी
| अभिकर्मक | निर्माता | क्याटलग |
| क्यासिन प्राविधिकगोजातीय दूधबाट | सिग्मा एल्ड्रिच | C7078 |
| NaOH | सिनोफार्म केमिकलअभिकर्मक कं, लिमिटेड | 10019762 |
| NaH2PO4२ घन्2O | सिनोफार्म केमिकलअभिकर्मक कं, लिमिटेड | 20040718 |
| Na2HPO4 | सिनोफार्म केमिकलअभिकर्मक कं, लिमिटेड | 20040618 |
| Trichloroacetic एसिड | सिनोफार्म केमिकलअभिकर्मक कं, लिमिटेड | ८०१३२६१८ |
| सोडियम एसीटेट | सिनोफार्म केमिकलअभिकर्मक कं, लिमिटेड | 10018818 |
| एसिटिक एसिड | सिनोफार्म केमिकलअभिकर्मक कं, लिमिटेड | 10000218 |
| HCl | सिनोफार्म केमिकलअभिकर्मक कं, लिमिटेड | 10011018 |
| सोडियम कार्बोनेट | सिनोफार्म केमिकलअभिकर्मक कं, लिमिटेड | 10019260 |
| फोलिन-फिनोल | सांगोन बायोटेक (शाङ्घाई)कम्पनि लिमिटेड। | A500467-0100 |
| एल-टाइरोसिन | सिग्मा | ९३८२९ |
अभिकर्मक I:
सब्सट्रेट: बोवाइन मिल्क घोलबाट १% क्यासिन: ०.१ एम सोडियम फस्फेट घोल, पीएच ८.० को ५० मिलीलीटरमा १ ग्राम गोवाइन मिल्क क्यासिन घोलाउनुहोस्, पानीको नुहाउने ठाउँमा ६५-७० डिग्री सेल्सियसमा १५ मिनेटको लागि तातो गर्नुहोस्, हलचल र घुलाउनुहोस्, पानीसँग चिसो गर्नुहोस्, समायोजन गर्नुहोस्। सोडियम हाइड्रोक्साइड pH 8.0 मा, र 100ml मा पातलो।
अभिकर्मक II:
TCA समाधान: ०.१ एम ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड, ०.२ एम सोडियम एसिटेट र ०.३ एम एसिटिक एसिड (तौल १.६४ ग्राम ट्राइक्लोरोएसिटिक एसिड + १.६४ ग्राम सोडियम एसिटेट + १.७२४ एमएल एसिटिक एसिड क्रमिक रूपमा, ५० एमएल डिआयनाइज्ड पानी थप्नुहोस्, एचसी ४० मा मिलाउनुहोस् र एचसी ४० मा समायोजन गर्नुहोस्। 100ml)।
अभिकर्मक III:
०.४ मिटर सोडियम कार्बोनेट घोल (४.२४ ग्राम निर्जल सोडियम कार्बोनेटको तौल र १०० एमएल पानीमा घुल्ने)
अभिकर्मक IV:
फोलिन फिनोल अभिकर्मक: डियोनाइज्ड पानीसँग 5 पटक पातलो गर्नुहोस्।
अभिकर्मक V:
इन्जाइम पातलो: 0.1 एम सोडियम फास्फेट समाधान, pH 8.0।
अभिकर्मक VI:
L-tyrosine मानक समाधान: 0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol/ml L-tyrosine 0.2M HCl संग विघटित।
प्रक्रिया
1. UV-Vis स्पेक्ट्रोफोटोमिटर खोल्नुहोस् र फोटोमेट्रिक मापन चयन गर्नुहोस्।
2. तरंगदैर्ध्य 660nm को रूपमा सेट गर्नुहोस्।
3. पानी नुहाउने खोल्नुहोस्, तापमान 37 ℃ मा सेट गर्नुहोस्, 3-5 मिनेटको लागि तापमान अपरिवर्तित सुनिश्चित गर्नुहोस्।
4. 0.5mL सब्सट्रेटलाई 2mL सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबमा 37 ℃ पानीको नुहाउने ठाउँमा 10 मिनेटको लागि पूर्व तताउनुहोस्।
5. 10 मिनेटको लागि प्रिहेटेड सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबमा 0.5mL पातलो इन्जाइम समाधान निकाल्नुहोस्।खाली समूहको रूपमा इन्जाइम पातलो सेट गर्नुहोस्।
6. प्रतिक्रिया पछि तुरुन्तै 1.0 एमएल TCA अभिकर्मक थप्नुहोस्।राम्ररी मिलाउनुहोस् र 30 मिनेटको लागि पानीको नुहाउने ठाउँमा इन्क्युबेट गर्नुहोस्।
7. Centrifugate प्रतिक्रिया समाधान।
8. निर्दिष्ट क्रममा निम्न अवयवहरू थप्नुहोस्।
| अभिकर्मक | भोल्युम |
| सतही | ०.५ एमएल |
| 0.4M सोडियम कार्बोनेट | २.५ एमएल |
| फोलिन फिनोल अभिकर्मक | ०.५ एमएल |
९. पानीको बाथमा ३७ डिग्री सेल्सियसमा ३० मिनेटसम्म इन्क्युबिङ गर्नुअघि राम्ररी मिलाउनुहोस्।
10. OD६६०OD को रूपमा निर्धारण गरिएको थियो1;खाली नियन्त्रण समूह: ओडी निर्धारण गर्न इन्जाइम समाधान प्रतिस्थापन गर्न इन्जाइम डिलुएन्ट प्रयोग गरिन्छ६६०OD को रूपमा2, ΔOD=OD1-ओडी2.
11. L-tyrosine मानक वक्र: 0.5mL विभिन्न एकाग्रता L-tyrosine समाधान, 2.5mL 0.4M सोडियम कार्बोनेट, 0.5mL फोलिन फिनोल अभिकर्मक 5mL सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबमा, 37 ℃ मा 30 मिनेटको लागि इन्क्युबेट गर्नुहोस्, OD को लागि पत्ता लगाउनुहोस्।६६०L-tyrosine को विभिन्न एकाग्रताको लागि, त्यसपछि मानक वक्र Y=kX+b प्राप्त गरियो, जहाँ Y L-tyrosine एकाग्रता हो, X OD हो।६००.
गणना
२: प्रतिक्रिया समाधानको कुल मात्रा (mL)
०.५: इन्जाइम समाधानको मात्रा (एमएल)
0.5: क्रोमोजेनिक निर्धारण (mL) मा प्रयोग हुने प्रतिक्रिया तरल मात्रा
10: प्रतिक्रिया समय (मिनेट)
Df: मल्टिपल डिल्युसन
C: इन्जाइम एकाग्रता (mg/mL)
तथ्याङ्कहरू
Fig.1 DNA अवशेष
| नमूना | Ave C4 | न्यूक्लिक एसिड रिकभरी(pg/mg) | रिकभरी(%) | कुल न्यूक्लिक एसिड ( pg/mg) |
| PRK | २४.६६ | २.२३ | ८३% | 2.687 |
| PRK+STD2 | १८.७२३ | १२६.७२८ | - | - |
| STD1 | १२.९५५ |
- |
- |
- |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | १९.१२५ | |||
| STD4 | २३.१३५ | |||
| STD5 | २६.६२५ | |||
| RNA-मुक्त H2O | अनिश्चित | - | - | - |
Fig.2 इष्टतम pH
Fig.3 इष्टतम तापमान
Fig.4 pH स्थिरता
Fig.5 थर्मल स्थिरता
Fig.6 25℃ मा भण्डारण स्थिरता
