एन्डोफ्री प्लाज्मिड मैक्सी किट
यो किट 150 - 300 मिलीलीटर ब्याक्टेरिया सोल्युसनबाट निकासीको लागि उपयुक्त छ, जसले ब्याक्टेरियालाई लाइज गर्नको लागि सुधारिएको SDS-alkaline lysis विधि प्रयोग गरी रातभर कल्चर गरिएको छ।कच्चा निकासी एक अद्वितीय एन्डोटोक्सिन स्क्याभेन्जरसँग छानिएको छ र एन्डोटोक्सिन हटाउनको लागि सेन्ट्रीफ्यूगेशनद्वारा अलग गरिएको छ।त्यसपछि, सिलिका जेल झिल्ली उच्च-नुनको अवस्था र कम-पीएचको अवस्थाहरूमा समाधानमा प्लाज्मिड डीएनएसँग छनौट रूपमा बाँध्छ।यो अशुद्धता र अन्य ब्याक्टेरियल घटकहरू हटाउन धुने बफर थपेर पछ्याइएको छ।अन्तमा, सिलिकन म्याट्रिक्स झिल्लीबाट शुद्ध प्लाज्मिड डीएनए निकाल्न कम नुन, उच्च-पीएच इल्युसन बफर प्रयोग गरिन्छ।सिलिका जेल झिल्लीले विशेष सोखन झिल्लीलाई रोजगार दिन्छ, र स्तम्भ र स्तम्भ बीचको सोखना रकम भिन्नता धेरै सानो छ र दोहोर्याउने योग्यता राम्रो छ।फिनोल, क्लोरोफर्म र अन्य विषाक्त अभिकर्मकहरू आवश्यक पर्दैन, र न त इथेनोल वर्षा चरणहरू छन्।यो किट 80% -90% को निकासी दर संग, शुद्ध उच्च-प्रतिलिपि प्लाज्मिड DNA को 0.2 -1.5 मिलीग्राम द्रुत रूपमा निकाल्न प्रयोग गर्न सकिन्छ।किटले एन्डोटक्सिन हटाउने एक अद्वितीय प्रक्रिया सूत्र प्रयोग गर्दछ, एन्डोटक्सिनको सामग्री अत्यन्त कम छ र सेल ट्रान्सफेक्सन प्रभाव उत्कृष्ट छ।निकालिएको प्लाज्मिड इन्जाइम पाचन, PCR, भिट्रो ट्रान्सक्रिप्सन, रूपान्तरण, अनुक्रम र अन्य आणविक जीवविज्ञान प्रयोगहरूमा प्रत्यक्ष रूपमा प्रयोग गर्न सकिन्छ।
भण्डारण अवस्थाहरू
RNaseA -30 ~ -15 ℃ मा भण्डारण गर्नुपर्छ र ≤0 ℃ मा ढुवानी गर्नुपर्छ।
Endotoxin Scavenger लाई एक महिनाको लागि 2 ~ 8 ℃ मा भण्डारण गर्न सकिन्छ, लामो अवधिको भण्डारणको लागि -30 ~ -15 ℃ मा भण्डारण गर्न सकिन्छ।र ≤0 ℃ मा ढुवानी गरिन्छ।
अन्य कम्पोनेन्टहरू कोठाको तापक्रम (१५ ~ २५ डिग्री सेल्सियस) मा भण्डारण गरि कोठाको तापक्रममा ढुवानी गरिनुपर्छ।
अवयवहरू
| अवयवहरू | 10RXNS |
| आरनेस ए | 750 μL |
| बफर P1 | ७५ एमएल |
| बफर P2 | ७५ एमएल |
| बफर P4 | ७५ एमएल |
| एन्डोटोक्सिन स्क्याभेन्जर | 25 मिलीलीटर |
| बफर PW | 2 × 22 मिलीलीटर |
| बफर TB | 20 मिलीलीटर |
| FastPure DNA मैक्सी स्तम्भहरू (प्रत्येक 50ml सङ्कलन ट्यूबमा) | 10 |
| Endotoxin-मुक्त संग्रह ट्यूब | २ × ५ |
RNaseA:10 mg/ml, RNA हटाउन प्रयोग गरियो।
बफर P1:ब्याक्टेरियल निलम्बन बफर, पहिलो प्रयोग गर्नु अघि बफर P1 मा RNaseA थप्नुहोस्।
बफर P2:ब्याक्टेरियल लाइसिस बफर (SDS/NaOH युक्त)।
बफर P4:तटस्थ बफर।
एन्डोटोक्सिन स्क्याभेन्जर:प्रभावकारी रूपमा कच्चा प्लाज्मिड निकासीबाट endotoxin हटाउनुहोस्।
बफर PW:बफर धुनुहोस्, पहिलो प्रयोग गर्नु अघि इथानोलको निर्धारित मात्रा थप्नुहोस्।
बफर TB:इल्युसन बफर।
फास्टप्योर डीएनए मैक्सी स्तम्भहरू:प्लाज्मिड डीएनए अवशोषण स्तम्भहरू।
सङ्कलन ट्यूबहरू 50 मिलीलीटर:फिल्टर संग्रह ट्यूबहरू।
Endotoxin-रहित संग्रह ट्यूब:प्लाज्मिड डीएनए संग्रह ट्यूब।
तयार सामाग्री
निरपेक्ष इथेनॉल, आइसोप्रोपोनोल, ५० एमएल राउन्ड-बटम सेन्ट्रीफ्यूज ट्युब र ५० एमएल एन्डोटक्सिन-मुक्तसेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबहरू।
अनुप्रयोगहरू
यो उत्पादन ब्याक्टेरियल समाधान को 150 - 300 ml बाट प्लाज्मिड को ठूलो मात्रा को निकासी को लागी उपयुक्त छ।रातारात संस्कृति।
प्रयोग प्रक्रिया
150 - 200 ml (300 ml भन्दा बढी) को ब्याक्टेरियाको घोल रातभर कल्चर गरी लिनुहोस् र सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुहोस्।लगभग 11,000 rpm (12,000 × g) 1 - 2 मिनेटको लागि।सुपरनेटेन्ट त्याग्नुहोस् र ब्याक्टेरिया सङ्कलन गर्नुहोस्।
Δ ५० एमएलभन्दा बढी ब्याक्टेरियाको घोल सङ्कलन गर्दा, ब्याक्टेरियाको घोल, सेन्ट्रीफ्युगेशन, सुपरनेट्यान्ट खारेज गरी एउटै ५० एमएल ट्यूबमा अन्य चरणहरू थपेर ब्याक्टेरिया सङ्कलन गर्न सकिन्छ।
धेरै पटक।
2. सेन्ट्रीफ्यूजमा बफर P1 को 7.5 ml थप्नुहोस् (कृपया RNaseA बफर P1 मा थपिएको छ कि छैन भनेर जाँच गर्नुहोस्)ब्याक्टेरिया भएको ट्यूब र भोर्टेक्स वा पाइपिङद्वारा राम्ररी मिलाउनुहोस्।
Δ यस चरणमा ब्याक्टेरियाको पूर्ण पुन: निलम्बन उपजको लागि महत्त्वपूर्ण छ, र पुन: निलम्बन पछि कुनै ब्याक्टेरिया क्लम्पहरू हुनु हुँदैन।यदि त्यहाँ ब्याक्टेरियल क्लम्पहरू छन् जुन राम्ररी मिसाइएको छैन भने, यसले लिसिसलाई असर गर्छ, जसको परिणामस्वरूप कम उत्पादन र शुद्धता हुन्छ।यदि ब्याक्टेरियल घोलको OD600 0.65 छ भने, 150 ml ब्याक्टेरियल घोलबाट निकाल्दा 7.5 ml Buffer P1 प्रयोग गर्न सिफारिस गरिन्छ।जब OD600 0.75 हुन्छ, Buffer P1 को 8 ml प्रयोग गर्नुपर्छ र Buffers P2 र P4 को भोल्युमहरू तदनुसार परिवर्तन गर्नुपर्छ।यदि ब्याक्टेरियल घोलको मात्रा 200 मिलीलीटरमा बढाइयो भने, यो सिफारिस गरिन्छBuffers P1, P2, र P4 को मात्रा समानुपातिक रूपमा बढाइनेछ।
3. चरण 2 बाट ब्याक्टेरियल निलम्बनमा 7.5 मिलीलीटर बफर P2 थप्नुहोस् र 6 - 8 सम्म बिस्तारै माथि र तल मिलाउनुहोस्।पटक र 4-5 मिनेटको लागि कोठाको तापक्रममा इन्क्यूबेट गर्नुहोस्।
Δ राम्ररी मिलाउन बिस्तारै उल्टो गर्नुहोस्।भोर्टेक्सिङले जीनोमिक डीएनए खण्डीकरणको कारण बनाउँछ, जसको परिणामस्वरूप निकालिएको प्लाज्मिडमा जीनोमिक डीएनए टुक्राहरू हुन्छन्।यस समयमा, समाधान चिपचिपा र पारदर्शी हुन्छ, ब्याक्टेरिया पूर्ण रूपमा लाइसेड भएको देखाउँछ।प्लाज्मिडको विनाशबाट बच्नको लागि अवधि 5 मिनेट भन्दा बढी हुनु हुँदैन।यदि समाधान स्पष्ट छैन भने, त्यहाँ धेरै ब्याक्टेरिया परिणाम हुन सक्छअपूर्ण lysis, त्यसैले ब्याक्टेरिया को मात्रा उचित कम गर्नुपर्छ।
4. चरण 3 बाट ब्याक्टेरिया निलम्बनमा 7.5 ml को Buffer P4 थप्नुहोस् र तुरुन्तै 6 - 8 पटक बिस्तारै उल्टो गर्नुहोस् ताकि समाधानलाई पूर्ण रूपमा Buffer P2 लाई बेअसर गर्नुहोस्।यस समयमा, सेतो flocculent अवक्षेपण देखा पर्छ।10 - 15 मिनेटको लागि लगभग 11,000 rpm (12,000 × g) भन्दा बढीमा सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुहोस्, सावधानीपूर्वक नयाँ 50 मिलीलीटर राउन्ड-बटम सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूब (स्वयं-तयार) मा सुपरनेटेन्ट पिपेट गर्नुहोस् र बेवास्ता गर्नुहोस्।तैरिरहेको सेतो अवक्षेपणलाई एस्पिरेट गर्नुहोस्।
Δ बफर P4 थप्नुहोस् र राम्रोसँग मिलाउन तुरुन्तै उल्टो गर्नुहोस्।न्युट्रलाइजेसनलाई असर गर्न सक्ने स्थानीय वर्षाको उत्पादनलाई रोक्नको लागि सेतो अवक्षेपण समाधानमा समान रूपमा वितरण नभएसम्म ट्यूबलाई खडा हुन छोड्नुहोस्।यदि सेन्ट्रीफ्यूगेशन अघि एकसमान सेतो फ्लोकुलेन्ट अवक्षेपण छैन र सेन्ट्रीफ्यूगेशन पछि सुपरनेटेन्ट स्पष्ट छैन भने, ट्यूब हुन सक्छ।अर्को ५ मिनेटको लागि सेन्ट्रीफ्युज गरियो।
5. चरण 4 बाट सुपरनेटान्टमा एन्डोटोक्सिन स्क्याभेन्जरको 0. 1 गुणा भोल्युम (सुपरनेटन्ट भोल्युमको 10%, लगभग 2.2 एमएल) थप्नुहोस् र मिक्स गर्न उल्टो गर्नुहोस्।सोल्युसनलाई आइस बाथमा राख्नुहोस् वा कुचल बरफ (वा रेफ्रिजरेटर फ्रिजर) मा 5 मिनेट सम्म घुसाउनुहोस् जब सम्म समाधान टर्बिडबाट सफा र पारदर्शीमा परिवर्तन हुँदैन (वा अझै पनि।थोरै टर्बिड), र कहिलेकाहीँ धेरै पटक मिलाउनुहोस्।
Δ एन्डोटोक्सिन स्क्याभेन्जरलाई सुपरनेटेन्टमा थपेपछि, सुपरनेटेन्ट टर्बिड हुनेछ तरआइस बाथमा चिसो भएपछि सुपरनेटेन्ट स्पष्ट (वा थोरै टर्बिड) हुनुपर्छ।
6. सुपरनेट्यान्टलाई कोठाको तापक्रम (>25 ℃) मा 10 - 15 मिनेटको लागि राखेपछि, यो टर्बिड हुनेछयसको तापमान कोठाको तापक्रममा बढ्छ।त्यसपछि मिलाउनको लागि सुपरनेटेन्ट उल्टो हुनुपर्छ।
Δ यदि कोठाको तापक्रम कम छ वा तपाईं निकासी समय कम गर्न चाहनुहुन्छ भने, सुपरनेटेन्टलाई 37 ~ 42 ℃ पानीको बाथमा 5 - 10 मिनेटको लागि इन्क्युबेटेड गर्न सकिन्छ र अर्को चरण सुपरनेटेन्ट पछि गर्न सकिन्छ।धमिलो बन्छ।
७. फेज अलग गर्नको लागि कोठाको तापक्रममा १० मिनेटको लागि लगभग ११,००० rpm (12,000 × g) मा सुपरनेटेन्टलाई सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुहोस् (तापमान >25 ℃ हुनुपर्छ)।माथिल्लो जलीय चरणमा डीएनए हुन्छ भने तल्लो नीलो तेलको तहमा एन्डोटक्सिन र अन्य अशुद्धताहरू हुन्छन्।स्थानान्तरण गर्नुहोस्DNA- युक्त जलीय चरण एक नयाँ ट्यूब रतेल तह त्याग्नुहोस्।
Δ सेन्ट्रीफ्युगेशनको समयमा तापमान 25 ℃ भन्दा माथि हुनुपर्छ किनकि प्रभावकारी चरण विभाजनले गर्दैनयदि तापमान धेरै कम छ भने।
Δ यदि चरण विभाजन प्रभावकारी छैन भने, सेन्ट्रीफ्यूगेशन तापमान 30 ℃ मा समायोजित गर्न सकिन्छ रcentrifugation को समय 15 मिनेट सम्म बढाउन सकिन्छ।
Δ नीलो तैलीय तहलाई नचसाउनुहोस् किनभने यसमा एन्डोटक्सिन र अन्य अशुद्धताहरू हुन्छन्।
संयन्त्र
रिस्पेंशन लाइसिस तटस्थीकरण
◇ 7.5 ml बफर P1 थप्नुहोस्
◇ 7.5 ml बफर P2 थप्नुहोस्
◇ 7.5 ml बफर P4 थप्नुहोस्
Endotoxin हटाउने
◇ Endotoxin Scavenger को 0. 1 गुणा supernatant मात्रा थप्नुहोस्
बाइन्डिङ र धुने
◇ isopropanol को मात्रा 0.5 गुणा थप्नुहोस्
◇ 10 ml बफर PW थप्नुहोस्
◇ 10 ml बफर PW थप्नुहोस्
इलुसन
◇ 1 - 2 ml बफर TB वा Endotoxin-रहित ddH2O थप्नुहोस्
