प्लान्ट प्रत्यक्ष PCR किट

बिरालो नम्बर: HCR2020A

प्लान्ट डाइरेक्ट पीसीआर किट बिरुवाका पातहरू, बीउहरू, इत्यादिको प्रत्यक्ष प्रवर्धनको लागि उपयुक्त छ, र बिरुवाको नमूनाहरूको उच्च-थ्रुपुट स्क्रीनिंगको लागि प्रयोग गर्न सकिन्छ जसमा पोलिसेकराइडहरू र पोलिफेनोलहरू छैनन्।निर्देशित विकासमा आधारित प्रत्यक्ष प्रवर्द्धन DNA पोलिमरेजले बिरुवाहरूमा PCR अवरोधकहरूको लागि उच्च सहनशीलता छ।यसैबीच, यसले उच्च प्रवर्धन कार्यसम्पादनलाई कायम राख्छ, जुन 5 kb भित्र DNA टुक्राहरूको प्रवर्धनको लागि उपयुक्त छ।किटमा रहेको अद्वितीय लाइसिस बफर ए ताजा वा जमेको बिरुवाको तन्तुलाई लिज गर्न प्रयोग गर्न सकिन्छ।यो सञ्चालन गर्न सजिलो छ र lysate शुद्धीकरण बिना प्रवर्धनको लागि टेम्प्लेटको रूपमा प्रयोग गर्न सकिन्छ।प्रणालीमा सुरक्षात्मक एजेन्टहरू छन् जसले कच्चा नमूनाहरूलाई दोहोर्याइएको चिसो र पग्लिएपछि प्रभावकारी रूपमा विस्तार गर्न सक्षम बनाउँछ।2 × प्लान्ट डाइरेक्ट मास्टर मिक्सले एम्प्लीफिकेशन प्रतिक्रिया गर्न प्राइमरहरू र टेम्प्लेटहरू मात्र थप्न आवश्यक छ, जसले गर्दा पाइपिङ सञ्चालनहरू घटाउन र परिणामहरूको पत्ता लगाउने थ्रुपुट र पुन: उत्पादन क्षमतामा सुधार हुन्छ।

अवयवहरू

*प्लान्ट डाइरेक्ट लाइसिस बफर बी एक वैकल्पिक अभिकर्मक हो, जुन नमूनाहरूको भण्डारण समय लम्ब्याउन प्लान्ट डाइरेक्ट लाइसिस बफर ए लाई बेअसर गर्न प्रयोग गरिन्छ।यो वास्तविक स्थिति अनुसार प्रयोग गर्न सकिन्छ।

भण्डारण सर्तहरू

2 × प्लान्ट डाइरेक्ट मास्टर मिक्स, -30 ~ -15 ℃ मा भण्डार गर्नुहोस् र बारम्बार चिसो र पग्लनबाट जोगिन;प्लान्ट डाइरेक्ट लाइसिस बफर, -30 ~ -15 ℃ वा 2 ~ 8 ℃ मा भण्डार गर्नुहोस्।

प्रयोग प्रक्रिया

नमूना प्रशोधन-बिरुवाको पात

प्रत्यक्ष विधि:यो जवान पातहरू प्रयोग गर्न सिफारिस गरिएको छ।सानो र एकसमान नमूना प्राप्त गर्न 0.5 - 3 मिमी को निश्चित व्यास भएको प्वाल पंच प्रयोग गर्नुहोस्, र त्यसपछि सीधा PCR प्रणालीमा नमूना थप्नुहोस् (50 μl प्रणाली सिफारिस गरिएको छ)।ध्यान दिनुहोस्, नमूना PCR समाधानमा छ र ट्यूब भित्ता विरुद्ध छैन।यदि प्रत्यक्ष पीसीआर लामो टुक्रा र जटिल नमूनाहरू विस्तार गर्न प्रयोग गरिन्छ भने, टेम्प्लेटको रूपमा सानो व्यास (0.5 - 1 मिमी) को नमूना प्रयोग गरेर राम्रो परिणाम प्राप्त गर्न मद्दत गर्न सक्छ।

पीस लिसिस विधि:यो जवान पातहरू प्रयोग गर्न सिफारिस गरिएको छ।पातको सानो टुक्रा लिनुहोस् (लगभग 1 - 3 मिमी व्यासमा), यसलाई 20 μl प्लान्ट डाइरेक्ट लाइसिस बफर एबमा राख्नुहोस्, र यसलाई सकेसम्म पीस गर्नुहोस् (यो चरण 100 μl पिपेट टिपको साथ पात निचोड गरेर गर्न सकिन्छ। नमूना म्यास गर्न)।यदि पातको तन्तुको ठूलो मात्रा प्रयोग गरिन्छ (७ मिमी भन्दा बढि नहोस्), डिल्युसन बफरको मात्रा ५० μl मा बढाउनुहोस्।पातहरू जमिन पछि, समाधान हरियो देखिनु पर्छ।छोटो सेन्ट्रीफ्युगेसन पछि, प्रतिक्रिया टेम्प्लेटेकको रूपमा PCR प्रणालीमा सुपरनेटान्टको 1 μl थप्नुहोस्।

थर्मल लिसिस विधि:यो जवान पातहरू प्रयोग गर्न सिफारिस गरिएको छ।पातको सानो टुक्रा (लगभग 1 - 3 मिमी व्यास) लिनुहोस्, यसलाई 20 μl प्लान्ट डाइरेक्ट लाइसिस बफर ए मा राख्नुहोस्, र 5 - 10 मिनेटको लागि 95 डिग्री सेल्सियसमा तातो गर्नुहोस्।लाइसिस समयलाई लिज गर्न गाह्रो हुने पातहरूको लागि उचित रूपमा विस्तार गर्न सकिन्छ (20 मिनेट भन्दा बढी)।यदि पातको तन्तुको ठूलो मात्रा प्रयोग गरिन्छ (७ मिमी भन्दा बढि नहोस्), डिल्युसन बफरको मात्रा ५० μl मा बढाउनुहोस्।तताउन पछि, छोटकरीमा सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुहोस्, र प्रतिक्रिया टेम्प्लेटको रूपमा PCR प्रणालीमा 1 μl supernatant थप्नुहोस्।

नमूना प्रशोधन- बीउ रोप्नुहोस्

पीस लिसिस विधि:५ मिलिमिटरको व्यास भएको बीउ काट्न स्केलपेल प्रयोग गर्नुहोस्, तिनीहरूलाई प्लान्ट डाइरेक्ट लाइसिस बफर ए को १०० μl मा थप्नुहोस्, र नमूनालाई पिपेट टिप वा अन्य उपकरणले पीस गर्नुहोस्।भोर्टेक्स छोटकरीमा राख्नुहोस् र कोठाको तापक्रममा ३-५ मिनेटको लागि खडा हुन दिनुहोस्।निश्चित गर्नुहोस् कि बीउ नमूना पातलो बफरमा डुबाइएको छ।छोटो सेन्ट्रीफ्युगेसन पछि, प्रतिक्रिया टेम्प्लेटको रूपमा PCR प्रणालीमा सुपरनेटेन्टको 1 μl थप्नुहोस्।

थर्मल लिसिस विधि:५ मिलिमिटर व्यास भएको बीउ काट्न स्केलपेल प्रयोग गर्नुहोस्, तिनीहरूलाई प्लान्ट डाइरेक्ट लाइसिस बफर ए को १०० μl मा थप्नुहोस्, र 5 - 10 मिनेटको लागि 95 डिग्री सेल्सियसमा तातो गर्नुहोस्।लाइसिस समयलाई लिज गर्न गाह्रो हुने पातहरूको लागि उचित रूपमा विस्तार गर्न सकिन्छ (30 मिनेट भन्दा बढी)।तताइसकेपछि, छोटकरीमा सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुहोस्, र प्रतिक्रिया टेम्प्लेटको रूपमा PCR प्रणालीमा 1 μl supernatant थप्नुहोस्।

aकैंची वा अन्य उपकरणहरू पनि उपयुक्त आकारको नमूनाहरू काट्न प्रयोग गर्न सकिन्छ;यदि मुक्का वा कैंची पुन: प्रयोग गरिन्छ भने, नमूनाहरू बीच क्रस-प्रदूषण रोक्न प्रत्येक प्रयोग गर्नु अघि तिनीहरूलाई 2% सोडियम हाइपोक्लोराइट घोलले सफा गर्नुपर्छ।

bप्रयोग गर्नु अघि प्लान्ट डाइरेक्ट लाइसिस बफर पूर्ण रूपमा पग्लिएको छ भनी सुनिश्चित गर्नुहोस्।यदि बफर चिपचिपा छ वा अवक्षेपण छ भने, यसलाई 37 ℃ मा तताउन सकिन्छ यसलाई प्रयोग गर्नु अघि पूर्ण रूपमा पग्लन।

गप्रतिक्रिया प्रणालीमा टेम्प्लेटको भोल्युम प्लान्ट सामग्री र पातलो थपिएको मात्रामा भिन्नता अनुसार उचित समायोजन गर्न सकिन्छ।

प्लान्ट डायरेक्ट लाइसिस बफर

यस उत्पादनमा रहेको प्लान्ट डाइरेक्ट लाइसिस बफर एलाई धेरैजसो बिरुवाका तन्तुहरूको जीनोम रिलिज गर्न कडाईका साथ अनुकूलित गरिएको छ र कच्चा बिरुवाहरूको 4℃ मा छोटो अवधिको भण्डारणको लागि उपयुक्त छ।यदि नमूना लामो समय (जस्तै, 1 - 2 महिना) को लागि भण्डारण गर्न आवश्यक छ भने, यो supernatant लाई नयाँ EP ट्यूबमा स्थानान्तरण गर्न र यसलाई -20℃ मा भण्डारण गर्न सिफारिस गरिन्छ।नमूनाहरूलाई थप स्थिर रूपमा भण्डारण गर्न, ट्रान्सफर गरिएको सुपरनेटेन्टमा प्लान्ट डाइरेक्ट लाइसिस बफर बीको बराबर मात्रा थप्नुहोस्, राम्ररी मिलाउनुहोस् र -20℃ मा भण्डार गर्नुहोस्।स्थिर भण्डारण समय बिरुवा नमूना र राज्यहरु संग भिन्न हुन्छ।

प्रतिक्रिया प्रणाली

aयसमा एमजी हुन्छ²⁺2 mM को अन्तिम एकाग्रतामा।

bप्रत्येक प्राइमरको लागि 0.4μM को अन्तिम एकाग्रता प्रयोग गर्न सिफारिस गरिन्छ।प्राइमरहरूको अत्यधिक प्रयोगले बढ्दो गैर-विशिष्ट प्रवर्धनको नेतृत्व गर्नेछ।

गप्रयोग गरिएको नमूनाको मात्रा वास्तविक स्थिति अनुसार समायोजन गर्न सकिन्छ।कच्चा lysed नमूना को एकल प्रतिक्रिया मा प्रयोग मात्रा प्रतिक्रिया को कुल मात्रा को 2% - 20% को बीच समायोजित गर्न सकिन्छ।धेरै नमूनाहरू प्रयोग गर्दा प्रवर्धन विफलता हुन सक्छ।

प्रतिक्रिया कार्यक्रम

aप्रारम्भिक विकृतीकरण (98 ℃, 5 मिनेट) ले बिरुवाको तन्तुको लिसिसलाई बढावा दिन्छ, जीनोमिक डीएनए जारी गर्दछ जुन PCR प्रवर्धनको लागि प्रयोग गर्न सकिन्छ।समय छोटो नगर्नुहोस् वा तापमान घटाउनुहोस्।

bयसलाई प्राइमर Tm मान बराबर वा Tm मान भन्दा २ ~ ४ ℃ उच्च सेट गर्न सिफारिस गरिन्छ।यस उत्पादनमा प्रयोग गरिएको प्रत्यक्ष प्रवर्धन DNA पोलिमरेज परम्परागत Taq DNA पोलिमरेज भन्दा फरक छ, र प्रतिक्रिया annealing तापमान को लागि विशेष आवश्यकताहरु छ; उच्च annealing तापमान को प्रयोग प्रभावकारी रूपमा nonspecific प्रवर्धन कम गर्न र प्रवर्धन दक्षता सुधार गर्न सक्छ।जटिल टेम्प्लेटहरूको लागि, कुशल प्रवर्द्धन annealing तापमान समायोजन र विस्तार समय लम्ब्याएर प्राप्त गर्न सकिन्छ।

गयदि प्रवर्धन उत्पादनको लम्बाइ ≤1 kb छ भने, विस्तार समय 30 सेकेन्ड/kb मा सेट गरिएको छ;यदि प्रवर्धन उत्पादनको लम्बाइ >1 kb छ भने, विस्तार समय 60 सेकेन्ड/kb मा सेट गरिएको छ।

dजटिल नमूनाहरू वा कम प्रवर्द्धन उपजका नमूनाहरूका लागि, चक्रहरूको संख्या उचित रूपमा 40-50 चक्रहरूमा बढाउन सकिन्छ।

अनुप्रयोगहरू

यो बिरुवाको तन्तुहरूको प्रत्यक्ष प्रवर्धन र बिरुवाको नमूनाहरूको उच्च-थ्रुपुट स्क्रिनिङको लागि लागू हुन्छ जसमा पोलिसेकराइडहरू र पोलिफेनोलहरू छैनन्।

नोटहरू

अनुसन्धानको लागि मात्र प्रयोग गर्नुहोस्।डायग्नोस्टिक प्रक्रियाहरूमा प्रयोगको लागि होइन।

1. कच्चा बिरुवा प्रवर्द्धन वा प्रत्यक्ष प्रवर्द्धनका लागि, प्रणाली, प्राइमर र अपरेशनहरू सही छन् भनी सुनिश्चित गर्न प्रयोग सुरु गर्नु अघि सकारात्मक नियन्त्रणको रूपमा शुद्ध जीनोमिक डीएनए प्रयोग गर्न सिफारिस गरिन्छ।

2. यस किटमा प्रयोग गरिएको प्रत्यक्ष प्रवर्धन DNA पोलिमरेजसँग बलियो प्रूफरीडिङ गतिविधि छ।यदि टीए क्लोनिङ गर्न आवश्यक छ भने, एडिनिन थप्नु अघि डीएनए शुद्ध गर्न सिफारिस गरिन्छ।

3. प्राइमर डिजाइन मार्गदर्शन:

aयो सिफारिस गरिएको छ कि प्राइमरको 3′ छेउमा अन्तिम आधार G वा C हुनुपर्छ।

bप्राइमरको 3′ अन्तमा अन्तिम 8 आधारहरूमा लगातार बेमेलहरू बेवास्ता गर्नुपर्छ।गप्राइमरको 3′ छेउमा हेयरपिन संरचनाहरूबाट बच्नुहोस्।

dअगाडि प्राइमर र रिभर्स प्राइमरको Tm मानमा भिन्नताहरू 1℃ भन्दा बढी हुनु हुँदैन र Tm मान 60 ~ 72℃ मा समायोजन गरिनु पर्छ (Tm मान गणना गर्न प्राइमर प्रिमियर 5 सिफारिस गरिएको छ)।

eटेम्प्लेटसँग नमिल्ने अतिरिक्त प्राइमर अनुक्रमहरू, प्राइमर Tm मान गणना गर्दा समावेश गर्नु हुँदैन।

fप्राइमरको GC सामग्री 40% -60% हुन सिफारिस गरिन्छ।

gप्राइमरमा A, G, C र T को समग्र वितरण सम्भव भएसम्म समान हुनुपर्छ।उच्च GC वा AT सामग्री भएका क्षेत्रहरू प्रयोग नगर्नुहोस्।

h।प्राइमर भित्र वा दुई प्राइमरहरू बीचको 5 वा बढी आधारहरूको पूरक अनुक्रमहरूको उपस्थितिलाई बेवास्ता गर्नुहोस् र दुई प्राइमरहरूको 3′ छेउमा 3 वा बढी आधारहरूको पूरक अनुक्रमहरूको उपस्थितिलाई बेवास्ता गर्नुहोस्।

iगैर-विशिष्ट प्रवर्धन रोक्नको लागि प्राइमरको विशिष्टता जाँच गर्न NCBI BLAST प्रकार्य प्रयोग गर्नुहोस्।