माउस जेनोटाइपिङ किट
बिरालो नम्बर: HCR2021A
यो उत्पादन DNA कच्चा निकासी र PCR प्रवर्धन प्रणाली सहित माउस जीनोटाइपहरूको द्रुत पहिचानको लागि डिजाइन गरिएको किट हो।लाइसिस बफर र प्रोटिनेज के द्वारा साधारण क्लीभेज पछि माउसको पुच्छर, कान, औंला र अन्य तन्तुहरूबाट सीधा पीसीआर प्रवर्धनको लागि उत्पादन प्रयोग गर्न सकिन्छ।कुनै रातभर पाचन छैन, फिनोल-क्लोरोफर्म निकासी वा स्तम्भ शुद्धिकरण, जुन सरल छ र प्रयोगहरूमा लाग्ने समयलाई छोटो पार्छ।उत्पादन 2kb सम्म लक्ष्य टुक्राहरूको प्रवर्धन र 3 जोडा प्राइमरहरू सम्म मल्टिप्लेक्स PCR प्रतिक्रियाहरूको लागि उपयुक्त छ।२×माउस टिस्यु डाइरेक्ट पीसीआर मिक्सले आनुवंशिक रूपमा इन्जिनियर गरिएको डीएनए पोलिमरेज, एमजी समावेश गर्दछ।2+, dNTPs र उच्च प्रवर्द्धन दक्षता र अवरोधक सहिष्णुता प्रदान गर्न एक अनुकूलित बफर प्रणाली, ताकि PCR प्रतिक्रियाहरू टेम्प्लेट र प्राइमरहरू थपेर र उत्पादनलाई 1× मा रिहाइड्रेट गरेर गर्न सकिन्छ।यस उत्पादनसँग विस्तारित PCR उत्पादनको 3′ छेउमा एक प्रमुख "A" आधार छ र शुद्धीकरण पछि TA क्लोनिङको लागि सीधै प्रयोग गर्न सकिन्छ।
अवयवहरू
| कम्पोनेन्ट | साइज |
| 2×माउस टिस्यु प्रत्यक्ष पीसीआर मिक्स | ५ × १.० एमएल |
| लाइसिस बफर | 2×20mL |
| प्रोटिनेज के | 800μL |
भण्डारण सर्तहरू
उत्पादनहरू -25 ~ -15 ℃ मा 2 वर्षको लागि भण्डारण गर्नुपर्छ।पग्लिसकेपछि, लाइसिस बफरलाई छोटो अवधिको धेरै प्रयोगको लागि २ ~ ८ ℃ मा भण्डारण गर्न सकिन्छ, र प्रयोग गर्दा राम्ररी मिश्रण गर्न सकिन्छ।
आवेदन
यो उत्पादन माउस नकआउट विश्लेषण, ट्रान्सजेनिक पत्ता लगाउने, जीनोटाइपिङ र यस्तै अन्य लागि उपयुक्त छ।
विशेषताहरु
१.सरल सञ्चालन: जीनोमिक डीएनए निकाल्न आवश्यक छैन;
२.फराकिलो आवेदन: विभिन्न माउस टिश्यूहरूको प्रत्यक्ष प्रवर्धनको लागि उपयुक्त।
निर्देशनहरू
१.जीनोमिक डीएनए को रिलीज
1) lysate को तयारी
टिस्यु लाइसेटलाई माउसको नमूनाहरूको सङ्ख्या अनुसार लाइज गर्नका लागि तयार गरिन्छ (टिश्यु लाइसेट डोज अनुसार साइटमा तयार हुनुपर्छ र प्रयोगको लागि राम्ररी मिसाउनु पर्छ), र एकल नमूनाको लागि आवश्यक अभिकर्मकहरूको अनुपात निम्नानुसार छ:
| अवयवहरू | भोल्युम (μL) |
| प्रोटिनेज के | 4 |
| लाइसिस बफर | २०० |
2) नमूना तयारी र Lysis
अनुशंसित टिश्यू प्रयोग
| को प्रकारटिस्यु | सिफारिस गरिएको भोल्युम |
| मुसाको पुच्छर | 1-3 मिमी |
| माउस कान | 2-5 मिमी |
| मुसाको औंला | 1-2 टुक्रा |
सफा सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबहरूमा माउस टिस्यु नमूनाहरूको उपयुक्त मात्रा लिनुहोस्, प्रत्येक सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबमा 200μL ताजा टिस्यू लाइसेट थप्नुहोस्, भोर्टेक्स र शेक गर्नुहोस्, त्यसपछि 30 मिनेटको लागि 55 ℃ मा इन्क्युबेट गर्नुहोस्, र त्यसपछि 3 मिनेटको लागि 98 ℃ मा तातो गर्नुहोस्।
3) सेन्ट्रीफ्यूगेशन
लाइसेटलाई राम्ररी हल्लाउनुहोस् र १२,००० आरपीएममा ५ मिनेटको लागि सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुहोस्।सुपरनेटेन्ट पीसीआर प्रवर्धनको लागि टेम्प्लेटको रूपमा प्रयोग गर्न सकिन्छ।यदि टेम्प्लेट भण्डारणको लागि आवश्यक छ भने, सुपरनेटेन्टलाई अर्को बाँझ सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबमा स्थानान्तरण गर्नुहोस् र -20 डिग्री सेल्सियसमा २ हप्ताको लागि भण्डार गर्नुहोस्।
२.पीसीआर प्रवर्धन
2×Mouse Tisue Direct PCR Mix लाई -20℃ बाट हटाउनुहोस् र बरफमा पग्लनुहोस्, उल्टो मिलाउनुहोस् र PCR प्रतिक्रिया प्रणाली निम्न तालिका अनुसार तयार गर्नुहोस् (बरफमा चलाउनुहोस्):
| अवयवहरू | 25μLप्रणाली | 50μLप्रणाली | अन्तिम एकाग्रता |
| 2×माउस टिस्यु प्रत्यक्ष पीसीआर मिक्स | 12.5μL | 25μL | १× |
| प्राइमर 1 (10μM) | 1.0μL | 2.0μL | ०.४μM |
| प्राइमर 2 (10μM) | 1.0μL | 2.0μL | ०.४μM |
| क्लीभेज उत्पादनa | आवश्यकता अनुसार | आवश्यकता अनुसार |
|
| ddH2O | 25μL सम्म | 50μL सम्म |
|
नोट:
a) थपिएको रकम प्रणालीको 1/10 भन्दा बढी हुनु हुँदैन, र यदि धेरै थपियो भने, PCR प्रवर्द्धन रोकिन सक्छ।
सिफारिस गरिएका PCR सर्तहरू
| साइकल चरण | अस्थायी। | समय | साइकलहरू |
| प्रारम्भिक विकृतीकरण | 94 ℃ | ५ मिनेट | 1 |
| विकृतीकरण | 94 ℃ | ३० सेकेन्ड | 35-40 |
| एनिलिङa | Tm+3~5℃ | ३० सेकेन्ड | |
| विस्तार | ७२ ℃ | ३० सेकेन्ड/केबी | |
| अन्तिम विस्तार | ७२ ℃ | ५ मिनेट | 1 |
| - | ४ ℃ | होल्ड गर्नुहोस् | - |
नोट:
क) एनिलिङ तापक्रम: प्राइमरको Tm मानको सन्दर्भमा, प्राइमरको सानो Tm मान +3 ~ 5 ℃ मा annealing तापमान सेट गर्न सिफारिस गरिन्छ।
साझा समस्या र समाधान
१.कुनै लक्षित स्ट्रिपहरू छैनन्
1) अत्यधिक lysis उत्पादन।टेम्प्लेटको सबैभन्दा उपयुक्त मात्रा छनौट गर्नुहोस्, सामान्यतया प्रणालीको 1/10 भन्दा बढी हुँदैन;
2) धेरै ठूलो नमूना आकार।lysate लाई 10 पटक पातलो गर्नुहोस् र त्यसपछि एम्प्लिफाइ गर्नुहोस्, वा नमूना आकार घटाउनुहोस् र पुन: lysis;
3) टिस्यु नमूनाहरू ताजा छैनन्।यो ताजा ऊतक नमूनाहरू प्रयोग गर्न सिफारिस गरिएको छ;
4) खराब प्राइमर गुणस्तर।प्राइमर गुणस्तर प्रमाणित गर्न र प्राइमर डिजाइनलाई अप्टिमाइज गर्न एम्प्लीफिकेशनको लागि जीनोमिक डीएनए प्रयोग गर्नुहोस्।
२.गैर-विशिष्ट प्रवर्धन
1) annealing तापमान धेरै कम छ र चक्र संख्या धेरै उच्च छ।annealing तापमान वृद्धि र चक्र को संख्या कम;
2) टेम्प्लेट एकाग्रता धेरै उच्च छ।टेम्प्लेटको मात्रा घटाउनुहोस् वा एम्प्लीफिकेशन पछि टेम्प्लेट १० पटक पातलो गर्नुहोस्;
3) खराब प्राइमर विशिष्टता।प्राइमर डिजाइन अप्टिमाइज गर्नुहोस्।
नोटहरू
१.नमूनाहरू बीच क्रस दूषित हुनबाट बच्न, धेरै नमूना उपकरणहरू तयार गर्नुपर्छ, र उपकरणहरूको सतहलाई 2% सोडियम हाइपोक्लोराइट घोल वा न्यूक्लिक एसिड क्लिनरले प्रत्येक नमूना पछि बारम्बार प्रयोग गर्न आवश्यक भएमा सफा गर्न सकिन्छ।
२.ताजा माउस टिस्युहरू प्रयोग गर्न सिफारिस गरिन्छ, र एम्प्लीफिकेशन परिणामहरूलाई असर गर्नबाट बच्न नमूनाको मात्रा धेरै ठूलो हुनु हुँदैन।
३.लाइसिस बफरले बारम्बार फ्रिज-थउबाट बच्नुपर्छ, र छोटो अवधिको बहु प्रयोगको लागि 2 ~ 8 ℃ मा भण्डारण गर्न सकिन्छ।यदि कम तापक्रममा भण्डारण गरियो भने, वर्षा हुन सक्छ, र प्रयोग गर्नु अघि पूर्ण रूपमा विघटन हुनुपर्छ।
४।PCR मिक्स बारम्बार फ्रिज-थउबाट बच्नुपर्छ, र छोटो अवधिको दोहोर्याइएको प्रयोगको लागि 4℃ मा भण्डारण गर्न सकिन्छ।
५।यो उत्पादन वैज्ञानिक प्रयोगात्मक अनुसन्धानको लागि मात्र हो र क्लिनिकल निदान वा उपचारमा प्रयोग गर्नु हुँदैन।
