M-MLV नियोस्क्रिप्ट रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज
नियोस्क्रिप्ट रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज मोलोनी मुरिन ल्युकेमिया भाइरस उत्पत्ति र E.coli मा अभिव्यक्तिको M-MLV जीनको उत्परिवर्तन स्क्रीनिंग द्वारा प्राप्त रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज हो।इन्जाइमले RNase H गतिविधिलाई हटाउँछ, उच्च तापमान सहिष्णुता छ, र उच्च-तापमान रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शनको लागि उपयुक्त छ।तसर्थ, यो आरएनए उच्च-स्तरको संरचना र सीडीएनए संश्लेषणमा गैर-विशिष्ट कारकहरूको प्रतिकूल प्रभावहरू हटाउनको लागि उपयोगी छ, र उच्च स्थिरता र रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन संश्लेषण क्षमता छ।इन्जाइमसँग उच्च स्थिरता र उल्टो ट्रान्सक्रिप्शन संश्लेषण क्षमता छ।
अवयवहरू
1.200 U/μL नियोस्क्रिप्ट रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज
2.५ × पहिलो-स्ट्र्यान्ड बफर (वैकल्पिक)
* 5 × फर्स्ट-स्ट्र्यान्ड बफरले dNTP समावेश गर्दैन, प्रतिक्रिया प्रणाली तयार गर्दा dNTP थप्नुहोस्
सिफारिस गरिएको आवेदन
1.एक-चरण qRT-PCR।
2.आरएनए भाइरस पत्ता लगाउने।
भण्डारण अवस्था
-20 डिग्री सेल्सियस लामो अवधिको भण्डारणको लागि, प्रयोग गर्नु अघि राम्ररी मिलाउनु पर्छ, बारम्बार फ्रिज-थउबाट बच्न।
एकाइ परिभाषा
एक एकाइले पाली(A)•oligo(dT) को प्रयोग गरी ३७°C मा १० मिनेटमा १ nmol dTTP समावेश गर्दछ25टेम्प्लेट/प्राइमरको रूपमा।
गुणस्तर नियन्त्रण
1.SDS-PAGE इलेक्ट्रोफोरेटिक शुद्धता 98% भन्दा बढी।
2.प्रवर्धन संवेदनशीलता, ब्याच-देखि-ब्याच नियन्त्रण, स्थिरता।
3.एक्सोजेनस न्यूक्लिज गतिविधि छैन, एक्सोजेनस एन्डोन्यूक्लिज वा एक्सोन्यूक्लिज प्रदूषण छैन
पहिलो चेन प्रतिक्रिया समाधानको लागि प्रतिक्रिया सेटअप
1.प्रतिक्रिया मिश्रण को तयारी
| अवयवहरू | भोल्युम |
| ओलिगो(dT)१२-18 प्राइमर वा अनियमित प्राइमरa वा जीन विशिष्ट प्राइमर्सb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| २ बजे | |
| 10 एमएम dNTP | १ μL |
| टेम्प्लेट आरएनए | कुल RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| RNase-मुक्त dH2O | 10 μL सम्म |
नोट:a/b: कृपया आफ्नो प्रयोगात्मक आवश्यकता अनुसार विभिन्न प्रकारका प्राइमरहरू चयन गर्नुहोस्।
2.5 मिनेटको लागि 65 डिग्री सेल्सियसमा तताउनुहोस् र 2 मिनेटको लागि बरफमा छिटो चिसो गर्नुहोस्।
3.माथिको प्रणालीमा निम्न अवयवहरू 20µL को कुल मात्रामा थप्नुहोस् र बिस्तारै मिश्रण गर्नुहोस्:
| अवयवहरू | मात्रा (μL) |
| 5 × पहिलो-स्ट्र्यान्ड बफर | 4 |
| नियोस्क्रिप्ट रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज (200 U/μL) | 1 |
| RNase अवरोधक (40 U/μL) | 1 |
| RNase-मुक्त dH2O | २० μL सम्म |
4. कृपया निम्न सर्तहरू अनुसार प्रतिक्रिया प्रदर्शन गर्नुहोस्:
(1) यदि अनियमित प्राइमर प्रयोग गरिन्छ भने, प्रतिक्रिया 10 मिनेटको लागि 25 ℃ मा, र त्यसपछि 30 ~ 60 मिनेटको लागि 50 ℃ मा गरिन्छ।
(२) यदि Oligo dT वा विशिष्ट प्राइमरहरू प्रयोग गरिन्छ भने, प्रतिक्रिया 30 ~ 60 मिनेटको लागि 50℃ मा गरिनुपर्छ।
5.नियोस्क्रिप्ट रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेसलाई निष्क्रिय पार्न र प्रतिक्रिया समाप्त गर्न 5 मिनेटको लागि 95℃ मा तातो गर्नुहोस्।
6.रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन उत्पादनहरू सीधा PCR प्रतिक्रिया र फ्लोरोसेन्स मात्रात्मक PCR प्रतिक्रियामा प्रयोग गर्न सकिन्छ, वा लामो समयको लागि -20℃ मा भण्डारण गर्न सकिन्छ।
पीसीआर आरक्रिया:
1.प्रतिक्रिया मिश्रण को तयारी
| अवयवहरू | एकाग्रता |
| १० × PCR बफर (dNTP नि:शुल्क, Mg²+ नि:शुल्क) | १× |
| dNTPs (10mm प्रत्येक dNTP) | 200 μM |
| २५ एमएम एमजीसीएल2 | 1-4 मिमी |
| Taq DNA पोलिमरेज (5U/μL) | 2-2.5 U |
| प्राइमर १ (१० μM) | ०.२-१ माइक्रोन |
| प्राइमर २ (१० μM) | ०.२-१ माइक्रोन |
| टेम्प्लेटa | ≤10% पहिलो चेन प्रतिक्रिया समाधान (2 μL) |
| ddH2O | 50 μL सम्म |
नोट:a: यदि धेरै धेरै पहिलो श्रृंखला प्रतिक्रिया समाधान थपियो भने, PCR प्रतिक्रिया अवरोध हुन सक्छ।
2.PCR प्रतिक्रिया प्रक्रिया
| चरण | तापक्रम | समय | साइकलहरू |
| प्रि-डिनेचरेशन | ९५ ℃ | २-५ मिनेट | 1 |
| विकृतीकरण | ९५ ℃ | 10-20 सेकेन्ड | ३०-४० |
| एनिलिङ | 50-60 ℃ | 10-30 सेकेन्ड | |
| विस्तार | ७२ ℃ | 10-60 सेकेन्ड |
नोटहरू
1.42 ℃ ~ 55 ℃ को दायरामा उल्टो ट्रान्सक्रिप्शन तापमान अनुकूलनको लागि उपयुक्त।
2.यो राम्रो स्थिरता छ, उच्च तापमान रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्रवर्धन को लागी उपयुक्त छ।थप रूपमा, यो RNA को जटिल संरचनात्मक क्षेत्रहरू मार्फत कुशलतापूर्वक पार गर्नको लागि अनुकूल छ।साथै, योएक-चरण मल्टिप्लेक्स फ्लोरोसेन्स मात्रात्मक RT-PCR पत्ता लगाउन उपयुक्त छ।
3.विभिन्न PCR एम्प्लीफिकेशन इन्जाइमहरूसँग राम्रो अनुकूलता र उच्च संवेदनशीलता RT-PCR प्रतिक्रियाहरूको लागि उपयुक्त छ।
4.उच्च संवेदनशीलता एक-चरण प्रतिदीप्ति मात्रात्मक RT-PCR प्रतिक्रियाको लागि उपयुक्त, टेम्प्लेटहरूको कम एकाग्रताको पहिचान दरलाई प्रभावकारी रूपमा सुधार गर्नुहोस्।
5.cDNA पुस्तकालय निर्माणको लागि उपयुक्त।
