डीएनए निकासी मिनी किट
यस किटले अप्टिमाइज्ड बफर प्रणाली र सिलिका जेल स्तम्भ शुद्धिकरण प्रविधि अपनाउछ, जसले TAE वा TBE agarose जेलको विभिन्न सांद्रताबाट 70 bp - 20 kb DNA टुक्राहरू पुनःप्राप्त गर्न सक्छ।DNA अवशोषण स्तम्भले उच्च नुन अवस्था अन्तर्गत DNA लाई विशेष रूपमा सोख्न सक्छ।थप रूपमा, किटले PCR उत्पादनहरू, इन्जाइमेटिक प्रतिक्रिया प्रणालीहरू वा अन्य विधिहरूद्वारा प्राप्त कच्चा DNA उत्पादनहरूबाट सीधै DNA टुक्राहरू शुद्ध गर्न सक्छ, र प्रोटीन, अन्य जैविक यौगिकहरू, अकार्बनिक नुन आयनहरू र ओलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमरहरू जस्ता अशुद्धताहरू हटाउन सक्छ।यसले यो सुनिश्चित गर्न सक्छ कि शुद्धीकरण 10-15 मिनेट भित्र पूरा गर्न सकिन्छ।शुद्ध DNA लाई सिधै ligation, transformation, enzyme digestion, in vitro transscription, PCR, sequencing, microinjection, आदि को लागी प्रयोग गर्न सकिन्छ।
भण्डारण अवस्थाहरू
-15 ~ -25 ℃ मा भण्डार गर्नुहोस् र कोठाको तापक्रममा ढुवानी गर्नुहोस्।
अवयवहरू
| अवयवहरू | (100 rxns) |
| बफर जीडीपी | 80 मिलीलीटर |
| बफर GW | 2 × 20 मिलीलीटर |
| इलुसन बफर | 20 मिलीलीटर |
| फास्टप्योर डीएनए मिनी स्तम्भ-जी | १०० |
बफर जीडीपी:DNA बाध्यकारी बफर।
बफर GW:धुने बफर;प्रयोग गर्नु अघि बोतलमा संकेत गरिएको भोल्युम द्वारा निरपेक्ष इथेनॉल थप्नुहोस्।
इलुसन बफर:इलुसन।
FastPure DNA मिनी स्तम्भ-G:DNA अवशोषण स्तम्भहरू।
सङ्कलन ट्यूबहरू 2 एमएल:फिल्टरको लागि सङ्कलन ट्यूबहरू।
तयार सामाग्री
1.5 मिलीलीटर स्टेरिलाइज्ड ट्यूबहरू, निरपेक्ष इथेनॉल र आइसोप्रोप्यानोल (जब DNA टुक्रा ≤100 bp, 1 भोल्युम थप्नुहोस्
isopropanol 1 भोल्युम जेल), पानी नुहाउने।
प्रयोग प्रक्रिया
प्रयोग गर्नु अघि ट्यागमा संकेत गरिए अनुसार बफर GW लाई पातलो गर्न 80 एमएल इथेनॉल थप्नुहोस्, कोठाको तापक्रममा भण्डार गर्नुहोस्।
संयन्त्र
1. PCR प्रतिक्रिया समाधान
जेल निकासी योजना: बराबर मात्रा बफर GDP PCR प्रतिक्रिया समाधान रिकभरी योजना थप्नुहोस्:भोल्युम बफरको 5 गुणा थप्नुहोस्
2. GDP जेलको भोल्युम गणना गर्नुहोस् (100 μl बराबर १०० मिलीग्राम)
जेल भंग गर्नुहोस्
3. 50 ~ 55 मा पूर्व तताउनुहोस्℃
4. बाँध धुनुहोस्
बफर GDP को 300 μL थप्नुहोस्*
बफर GW को 700 μL थप्नुहोस्
बफर GW को 700 μL थप्नुहोस्
5. एल्युट
20 - 30μL इल्युसन बफर वा विआयनीकृत पानी थप्नुहोस्
नोटहरू * यो चरण बिना PCR प्रतिक्रिया तरल पदार्थ रिकभरी
जेल निकासी कार्यक्रम
1. DNA को टुक्रा टुक्रा पार्न DNA इलेक्ट्रोफोरेसिस पछि, UV प्रकाश अन्तर्गत agarose जेलबाट DNA टुक्राको एकल स्ट्राइप निकाल्नुहोस्।जेलको स्पष्ट नमी अवशोषित गर्नको लागि शोषक कागज प्रयोग गर्न सिफारिस गरिन्छ र सकेसम्म अतिरिक्त एगारोज हटाएर जेल स्लाइसको आकार कम गर्नुहोस्।यसको भोल्युम गणना गर्न जेल स्लाइस (माइक्रोसेन्ट्रिफ्यूज ट्यूब बिना) तौल गर्नुहोस्: 100 मिलीग्राम जेलस्लाइसको भोल्युम लगभग 100 μL छ, घनत्व 1g/ml मानेर।
2. बराबर भोल्युम बफर GDP थप्नुहोस्, 50 ~ 55 ℃ मा 7-10 मिनेटको लागि इन्क्युबेट गर्नुहोस् (जेल साइज अनुसार, जेल पूर्ण रूपमा विघटन नभएसम्म इन्क्युबेशन समय समायोजन गर्नुहोस्)।इन्क्युबेशनको समयमा ट्यूबलाई २ पटक उल्टाउनुहोस्।
Δ बफर GDP को 1-3 भोल्युमको थपले DNA रिकभरी दक्षतालाई असर गर्दैन।यदि डीएनए टुक्रा <100 bp पुनःप्राप्त गर्न, बफर GDP को 3 मात्रा थप्न आवश्यक छ;जब जेलको टुक्रा पूर्णतया भंग हुन्छ, 1 भोल्युम आइसोप्रोपानोल थप्नुहोस् र राम्ररी मिलाउनुहोस्, त्यसपछि अर्को चरणमा जारी राख्नुहोस्।
3. नमूनालाई ट्यूबको तल्लो भागमा ल्याउन संक्षिप्त रूपमा सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुहोस्, सङ्कलन ट्यूबहरू 2 एमएलमा फास्टप्युर डीएनए मिनी स्तम्भ-जी घुसाउनुहोस्, ध्यानपूर्वक एक पटक 700 μL को समाधान स्थानान्तरण गर्नुहोस्।
फिल्टरेशन स्तम्भहरूमा समय, 30-60 सेकेन्डको लागि 12,000 rpm (13,800 X g) मा सेन्ट्रीफ्यूज।
4. फिल्टर खारेज गर्नुहोस् र स्तम्भमा बफर GDP को 300 μL थप्नुहोस्, 1 मिनेटको लागि कोठाको तापक्रममा इन्क्युबेट गर्नुहोस्, 30-60 सेकेन्डको लागि 12,000 rpm (13,800 X g) मा सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुहोस्।
5. फिल्टरलाई खारेज गर्नुहोस् र स्तम्भमा 700 μL बफर GW थप्नुहोस् (अहिले नै पूर्ण इथेनॉल थपिएको छ कि छैन जाँच गर्नुहोस्!) 30-60 सेकेन्डको लागि 12,000 rpm (13,800 X g) मा सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुहोस्।
Δ कृपया सोर्स्प्शन स्तम्भको भित्ता वरिपरि बफर GW थप्नुहोस्, वा Buffer GW ब्याक कभर थप्नुहोस् र यसलाई 2 - 3 पटक उल्टो मिक्स गर्नुहोस् ताकि ट्यूब भित्तामा नुनलाई पूर्ण रूपमा फ्लश गर्न मद्दत गर्नुहोस्।
6. चरण 5 दोहोर्याउनुहोस्।
Δ Buffer GW को साथ दुई पटक फ्लस गर्नाले नुन पूर्णतया हटाइएको छ र त्यसपछिका प्रयोगहरूमा हुने प्रभावलाई हटाउन सकिन्छ।
7. फिल्टर खारेज गर्नुहोस् र खाली स्तम्भलाई 12,000 rpm (13,800 X g) मा २ मिनेटको लागि सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुहोस्।
8. सफा 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबमा स्तम्भ घुसाउनुहोस्, स्तम्भ झिल्लीको केन्द्रमा 20 - 30 μL इल्युसन बफर थप्नुहोस्, 2 मिनेटको लागि इन्क्युबेट गर्नुहोस्, र त्यसपछि 12,000 rpm (13,800 X g) को लागि सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुहोस्।स्तम्भ खारेज गर्नुहोस्, प्राप्त DNA -20 मा भण्डार गर्नुहोस्।
Δ चरण 8 को सुपरनेटान्टलाई स्तम्भमा पुन: एल्युट गर्न स्थानान्तरण गर्दै र इल्युसन बफरलाई 55 मा प्रिहिट गर्दा (जब DNA टुक्रा > 3 kb) रिकभरी दक्षता बढाउन मद्दतकारी हुन सक्छ।
PCR उत्पादन रिकभरी कार्यक्रम
यो प्रोटोकल PCR उत्पादनहरू, इन्जाइमेटिक प्रतिक्रिया प्रणाली र अन्य DNA कच्चा उत्पादनहरू (आनुवंशिक DNA सहित) बाट DNA टुक्राहरू शुद्ध गर्न लागू हुन्छ।यो समाधानले विभिन्न न्यूक्लियोटाइडहरू, प्राइमरहरू, प्राइमर डाइमरहरू, नुन अणुहरू, इन्जाइमहरू र अन्य अशुद्धताहरूलाई कुशलतापूर्वक हटाउन सक्छ।
1. छोटकरीमा सेन्ट्रीफ्यूज PCR उत्पादनहरू, इन्जाइमेटिक प्रतिक्रिया समाधान, र अन्य DNA कच्चा उत्पादनहरू।पिपेटको साथ तिनीहरूको मात्रा अनुमान गर्नुहोस् र एक 1.5 मिलीलीटर वा 2 मिलीलीटर ट्यूबमा स्थानान्तरण गर्नुहोस्।100 μL सम्म भोल्युम सम्म ddH2O थप्नुहोस्;उच्च एकाग्रता भएको जीनोमिक DNA को लागि, ddH2O को साथ 300 μL मा पातलो गर्दा रिकभरी दक्षता सुधार गर्न मद्दत गर्नेछ।
2. बफर GDP को 5 भोल्युमहरू थप्नुहोस्, उल्टो वा भोर्टेक्सिङ गरेर राम्ररी मिलाउनुहोस्।यदि रुचिको DNA टुक्रा > 100 bp, अतिरिक्त 1.5 भोल्युमहरू (नमूना + बफर GDP) इथेनॉल थप्न आवश्यक छ।
3. सङ्कलन ट्यूबमा स्तम्भ फिर्ता घुसाउनुहोस्, स्तम्भमा मिश्रण स्थानान्तरण गर्नुहोस्, 30 - 60 सेकेन्डको लागि 12,000 rpm (13,800 ×g) मा सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुहोस्।यदि मिश्रित घोलको भोल्युम >700 μL छ भने, सोर्स्प्शन स्तम्भलाई सङ्कलन ट्यूबमा फिर्ता राख्नुहोस्, बाँकी समाधानलाई सोखन स्तम्भमा स्थानान्तरण गर्नुहोस्, र 30 - 60 सेकेन्डको लागि 12,000 rpm (13,800 × g) मा सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुहोस्।
4. अर्को कार्यसम्पादनले 08- 1/जेल निकासी कार्यक्रमको चरण 5 - 8 लाई जनाउँछ।
अनुप्रयोगहरू
TAE वा TBE agarose जेल को विभिन्न सांद्रता;PCR उत्पादनहरू, इन्जाइमेटिक प्रतिक्रिया प्रणाली वा अन्य कच्चा DNA उत्पादनहरू विभिन्न विधिहरूद्वारा प्राप्त।बाट बरामद टुक्राहरु दायरा70 bp -20 kb।
नोटहरू
अनुसन्धानको लागि मात्र प्रयोग गर्नुहोस्।डायग्नोस्टिक प्रक्रियाहरूमा प्रयोगको लागि होइन।
1. प्रयोग गर्नु अघि ट्यागमा संकेत गरिए अनुसार बफर GW लाई पातलो गर्न 80 एमएल इथेनॉल थप्नुहोस्, कोठाको तापक्रममा भण्डार गर्नुहोस्।
2. यदि बफर जीडीपी कम-तापमान भण्डारणको समयमा अवक्षेपण गर्न सजिलो छ भने, यसलाई प्रयोग गर्नु अघि केही समयको लागि कोठाको तापक्रममा राख्न सकिन्छ।यदि आवश्यक छ भने, यसलाई 37 डिग्री सेल्सियसको पानीको नुहाउने ठाउँमा पूर्व तताउन सकिन्छ जबसम्म अवक्षेपण पूर्ण रूपमा विघटन हुँदैन, र त्यसपछि यो मिश्रण पछि प्रयोग गर्न सकिन्छ।
3. पहिले नै पानी नुहाउने तापमान 50 ~ 55 ℃ मा सेट गर्नुहोस्।
4. 08-1/जेल एक्स्ट्र्याक्सन कार्यक्रम चरण 1 मा, जेल स्लाइसको साइजलाई कम गर्नाले घुलनशील समयलाई उल्लेखनीय रूपमा घटाउँछ र रिकभरी दक्षता बढाउँछ (लिनियराइज्ड DNA उच्च तापक्रममा लगातार पर्दामा हाइड्रोलाइज गर्न सजिलो हुन्छ)।DNA जेललाई UV मा लामो समयसम्म नदेखाउनुहोस्, किनकि पराबैंगनी किरणले DNA क्षति पुर्याउन सक्छ।
5. जेललाई 08- 1/जेल एक्स्ट्र्याक्सन कार्यक्रम चरण 2 मा पूर्ण रूपमा विघटन गर्नुहोस्, अन्यथा DNA रिकभरी दक्षतालाई गम्भीर रूपमा प्रभावित हुनेछ।
6. प्रिहिट इलुसन बफर वा ddH2O लाई 55 ℃ सम्म, जसले DNA इल्युसन दक्षता सुधार गर्न मद्दत गर्दछ।यसलाई 2.5 mM Tris-HCl, pH 7.0 - 8.5 को एल्युएन्टमा DNA भण्डारण गर्न सिफारिस गरिन्छ।
