RTL रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज
RTL रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज एक RNA टेम्प्लेटमा निर्भर DNA पोलिमरेज हो जसमा 3'→5' exonuclease गतिविधि छैन र RNase H गतिविधि छ।यो इन्जाइमले DNA को पूरक स्ट्र्यान्ड संश्लेषण गर्न टेम्प्लेटको रूपमा RNA प्रयोग गर्न सक्छ, जुन पहिलो-स्ट्र्यान्ड cDNA संश्लेषणमा लागू गर्न सकिन्छ, विशेष गरी RT-LAMP (लूप-मध्यस्थ आइसोथर्मल प्रवर्धन) को लागि।RTL रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज 1.0 सँग तुलना गर्दा, संवेदनशीलता उल्लेखनीय रूपमा सुधारिएको छ, थर्मल स्थिरता बलियो छ, र 65 डिग्री सेल्सियसमा प्रतिक्रिया अधिक स्थिर छ।RTL रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज (ग्लिसरोल फ्री) लाई लाइफिलाइज्ड तयारीहरू, lyophilized RT-LAMP अभिकर्मकहरू आदि तयार गर्न प्रयोग गर्न सकिन्छ।
एकाइ परिभाषा
एक एकाइले टेम्प्लेट-प्राइमरको रूपमा poly(A)•oligo(dT)25 को प्रयोग गरेर 50°C मा 20 मिनेटमा एसिड-प्रेसिपिटेबल सामग्रीमा 1 nmol dTTP समावेश गर्दछ।
अवयवहरू
| कम्पोनेन्ट | HC5008A-०१ | HC5008A-०२ | HC5008A-०३ |
| RTL रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज (ग्लिसरोल-मुक्त) (15U/μL) | ०.१ एमएल | १ एमएल | १० एमएल |
| 10×HC RTL बफर | १.५ एमएल | ४×१.५ एमएल | ५ × १० एमएल |
| MgSO4 (100mm) | १.५ एमएल | २×१.५ एमएल | 3 × 10 एमएल |
भण्डारण अवस्था
ढुवानी 0°C अन्तर्गत र -25°C~-15°C मा भण्डारण गर्नुहोस्।
गुणस्तर नियन्त्रण
- को अवशिष्ट गतिविधिEndonuclease:1 μg λDNA र RTL2.0 को 15 इकाइहरू भएको 50 μL प्रतिक्रियाले 37 ℃ मा 16 घण्टासम्म इन्क्युबेटेड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा नकारात्मक नियन्त्रण जस्तै ढाँचा देखाउँछ।
- को अवशिष्ट गतिविधिExonuclease:1 μg Hind Ⅲ पचाइएको λDNA र RTL2.0 को 15 इकाइहरू 37 ℃ मा 16 घण्टासम्म इन्क्युबेटेड भएको 50 μL प्रतिक्रियाले जेल इलेक्ट्रोफोरेसिसद्वारा नकारात्मक नियन्त्रण जस्तै ढाँचा देखाउँछ।
- को अवशिष्ट गतिविधिनिकसे:1 μg सुपरकोइल्ड pBR322 र RTL2.0 को 15 इकाइहरू 37°C मा 4 घण्टासम्म इन्क्युबेटेड भएको 50 μL प्रतिक्रियाले जेल इलेक्ट्रोफोरेसिसद्वारा नकारात्मक नियन्त्रण जस्तै ढाँचा देखाउँछ।
- को अवशिष्ट गतिविधिRNase:0.48 μg MS2 RNA र RTL2.0 को 15 इकाइहरू भएको 10 μL प्रतिक्रियाले 37 डिग्री सेल्सियसमा 4 घण्टाको लागि इन्क्युबेटेड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा नकारात्मक नियन्त्रण जस्तै ढाँचा देखाउँछ।
- ई कोलाई gDNA:संग मापनE.coliविशिष्ट HCD पत्ता लगाउने किट, RTL2.0 को 15 एकाइहरू 1 भन्दा कम समावेश गर्दछई कोलाईजीनोम।
प्रतिक्रिया सेटअप
cDNA संश्लेषण प्रोटोकल
| अवयवहरू | भोल्युम |
| टेम्प्लेट आरएनए ए | वैकल्पिक |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) वा अनियमित प्राइमर मिक्स (60uM) | २ μL |
| dNTP मिक्स (10mm प्रत्येक) | १ μL |
| RNase अवरोधक (40U/uL) | ०.५ μL |
| RTL रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज 2.0 (15U/uL) | ०.५ μL |
| 10×HC RTL बफर | २ μL |
| न्यूक्लिज-मुक्त पानी | 20 μL सम्म |
नोट:
1) कुल RNA को सिफारिस गरिएको खुराक 1ng ~ 1μg हो
2) mRNA को सिफारिस गरिएको खुराक 50ng ~ 100ng थियो
थर्मो-दिनचर्याको लागि साइकल चलाउने अवस्था प्रतिक्रिया:
| तापक्रम (°C) | समय |
| २५ डिग्री सेल्सियसa | ५ मिनेट |
| ५५ डिग्री सेल्सियस | १० मिनेटb |
| ८० डिग्री सेल्सियस | १० मिनेट |
नोट:
1) यदि अनियमित प्राइमर मिक्स प्रयोग गरिन्छ भने, 25 डिग्री सेल्सियसमा इन्क्युबेशन चरण।
2) यदि लक्ष्य प्राइमर मिक्स प्रयोग गरिएको छ भने, 10 ~ 30 मिनेटको लागि 55°C मा इन्क्युबेशन चरण।
RT-LAMP प्रोटोकल
| अवयवहरू | भोल्युम | अन्तिम एकाग्रता |
| टेम्प्लेट आरएनए | वैकल्पिक | ≥10 प्रतिहरू |
| dNTP मिक्स (10mm) | 3.5 μL | १.४ एमएम |
| FIP/BIP प्राइमर्स (25×) | १ μL | 1.6 μM |
| F3/B3 प्राइमर (25×) | १ μL | ०.२ μM |
| LoopF/LoopB प्राइमर्स (25×) | १ μL | ०.४ μM |
| RNase अवरोधक (40U/μL) | ०.५ μL | 20 U/प्रतिक्रिया |
| RTL रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज 2.0 (15U/μL) | ०.५ μL | 7.5 U/प्रतिक्रिया |
| Bst V2 DNA पोलिमरेज (8U/μL) | १ μL | 8 U/प्रतिक्रिया |
| MgSO4 (100mm) | 1.5 μL | ६ एमएम (कुल ८ एमएम) |
| 10×HC RTL बफर (वा 10×HC Bst V2 बफर) | 2.5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| न्यूक्लिज-मुक्त पानी | 25 μL सम्म | - |
नोट:
1) सङ्कलन गर्न छोटकरीमा भर्टेक्सिंग र सेन्ट्रीफ्यूज द्वारा मिश्रण गर्नुहोस्।1 घण्टाको लागि 65 डिग्री सेल्सियसमा स्थिर तापमान इन्क्युबेशन।
2) दुई बफरहरू अन्तरक्रियात्मक छन् र एउटै संरचना छ।
नोटहरू
1. यो उत्पादन -20 डिग्री सेल्सियस मा भण्डारण गर्दा सेतो ठोस बनाउँछ।यसलाई -20 डिग्री सेल्सियसबाट बाहिर निकाल्नुहोस् र लगभग 10 मिनेटको लागि बरफमा राख्नुहोस्।पग्लिसकेपछि, यसलाई हल्लाएर र मिश्रण गरेर प्रयोग गर्न सकिन्छ।
2. cDNA उत्पादन -20°C वा -80°C मा भण्डारण गर्न सकिन्छ वा PCR प्रतिक्रियाको लागि तुरुन्तै प्रयोग गर्न सकिन्छ।
3. RNase प्रदुषण रोक्न, कृपया प्रयोगात्मक क्षेत्र सफा राख्नुहोस्, र सञ्चालनको समयमा सफा पन्जा र मास्क लगाउनुहोस्।
