M-MLV रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज
RevScript रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेस जेनेटिक इन्जिनियरिङ् प्रविधिद्वारा प्राप्त गरिन्छ।यसमा उच्च सीडीएनए संश्लेषण क्षमता, थर्मल स्थिरता र प्रतिक्रिया तापमान सीमा (60 डिग्री सेल्सियस सम्म) छ।संश्लेषित cDNA उत्पादन 10 kb सम्म छ।यसले टेम्प्लेटहरूको आत्मीयता बढाउँछ र जटिल माध्यमिक संरचना वा कम प्रतिलिपि जीनहरू भएका RNA टेम्प्लेटहरूको उल्टो ट्रान्सक्रिप्शनको लागि उपयुक्त छ।
अवयवहरू
| कम्पोनेन्ट | HC2003B (10,000U) | HC2003B (5*10,000U) | HC2003B (200,000U) |
| RevScript रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज (200U/μL) | ५० μL | ५ × ५० μL | १ एमएल |
| 5 × RevScript बफर | 250 μL | १.२५ एमएल | ५ एमएल |
भण्डारण अवस्था
यो उत्पादन -25 डिग्री सेल्सियस ~ -15 डिग्री सेल्सियसमा 2 वर्षको लागि भण्डारण गर्नुपर्छ।
एकाइ परिभाषा
एक एकाइले 10 मिनेटमा 10 मिनेटमा 1 nmol dTTP को एसिड-अघुलनशील पदार्थमा 37°C मा Oligo(dT) लाई प्राइमरको रूपमा प्रयोग गर्दछ।
प्रतिक्रिया सेटअप
1.आरएनए टेम्प्लेटको विकृतिकरण (यो चरण वैकल्पिक हो, आरएनए टेम्प्लेटको विकृतिकरणले माध्यमिक संरचनाहरू खोल्न मद्दत गर्दछ, जसले पहिलो स्ट्र्यान्ड सीडीएनएको उत्पादनमा सुधार गर्दछ।)
| अवयवहरू | मात्रा (μL) |
| RNase फ्री ddH2O | 13 सम्म |
| ओलिगो(dT)18 (५० μmol/L) वा अनियमित प्राइमर (५० μmol/L) वा जीन विशिष्ट प्राइमर (2 μmol/L) | 1 |
| वा १ | |
| वा १ | |
| आरएनए टेम्प्लेट | X a |
नोट:
1) a: कुल RNA: 1-5 ug वा mRNA: 1-500 ng
2) 5 मिनेटको लागि 65 डिग्री सेल्सियसमा इन्क्युबिङ गर्नुहोस्, त्यसपछि 2 मिनेटको लागि चिसो गर्न तुरुन्तै बरफमा स्थानान्तरण गर्नुहोस्।प्रतिक्रिया तरल सङ्कलन गर्न संक्षिप्त सेन्ट्रीफ्युगेशन, निम्न तालिकामा देखाइए अनुसार उल्टो ट्रान्सक्रिप्शन प्रतिक्रिया समाधान थप्नुहोस्।बिस्तारै पिपेट मिश्रण गर्न।
१.प्रतिक्रिया मिश्रण को तयारी (20 μL मात्रा)
| अवयवहरू | मात्रा (μL) |
| अघिल्लो चरणको मिश्रण | 13 |
| ५ × बफर | 4 |
| dNTP मिक्स (10nmol/L) | 1 |
| उल्टो ट्रान्सक्रिप्टेज (200 U/μL) | 1 |
| RNase अवरोधक (40 U/μL) | 1 |
1.निम्न अवस्थाहरूमा प्रतिक्रिया प्रदर्शन गर्नुहोस्:
| तापक्रम (°C) | समय |
| २५ डिग्री सेल्सियसa | ५ मिनेट |
| ४२ डिग्री सेल्सियसb | १५-३० मिनेट |
| ८५ डिग्री सेल्सियसc | ५ मिनेट |
नोट:
१) क.यादृच्छिक हेक्सामरहरू प्रयोग गर्नका लागि मात्र 25 डिग्री सेल्सियसमा 5 मिनेटको लागि इन्क्युबट गर्न आवश्यक छ।Oligo (dT) प्रयोग गर्दा कृपया यो चरण छोड्नुहोस्18वा जीन विशिष्ट प्राइमर।
२) ख।सिफारिस गरिएको उल्टो ट्रान्सक्रिप्शन तापमान 42 डिग्री सेल्सियस हो, जटिल माध्यमिक संरचना वा उच्च GC सामग्री भएका टेम्प्लेटहरूको लागि, प्रतिक्रियाको तापमान 50-55 डिग्री सेल्सियसमा बढाउन सिफारिस गरिन्छ।
३) ग।रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेजलाई निष्क्रिय पार्न 5 मिनेटको लागि 85 डिग्री सेल्सियसमा तताउने।
4) उत्पादन प्रत्यक्ष रूपमा PCR वा qPCR प्रतिक्रियाहरूमा प्रयोग गर्न सकिन्छ, वा छोटो अवधिको भण्डारणको लागि -20 डिग्री सेल्सियसमा भण्डारण गर्न सकिन्छ।यो उत्पादनहरू aliguot र लामो-अवधि भण्डारणको लागि -80 डिग्री सेल्सियस मा भण्डारण गर्न सिफारिस गरिएको छ।बारम्बार फ्रिज-थवबाट बच्नुहोस्।
5) उत्पादन एक-चरण RT-qPCR को लागी उपयुक्त छ, प्रत्येक 25μL प्रतिक्रिया प्रणालीको लागि 10-20 U रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेज थप्न वा वास्तविक अवस्था अनुसार क्रमशः रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेजको मात्रा बढाउन सिफारिस गरिन्छ।
नोटहरू
1.कृपया प्रयोगात्मक क्षेत्र सफा राख्नुहोस्;सञ्चालन गर्दा सफा पन्जा र मास्क लगाउनुपर्छ।प्रयोगमा प्रयोग गरिएका सबै उपभोग्य वस्तुहरू RNase दूषित हुनबाट जोगाउन RNase मुक्त हुनुपर्छ।
2.सबै प्रक्रियाहरू बरफमा आरएनए गिरावट रोक्नको लागि प्रदर्शन गर्नुपर्छ।
3.रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शनको उच्च दक्षता सुनिश्चित गर्न उच्च गुणस्तरको आरएनए नमूनाहरू सिफारिस गरिन्छ।
4.यो उत्पादन अनुसन्धान प्रयोगको लागि मात्र हो।
5.कृपया आफ्नो सुरक्षाको लागि प्रयोगशाला कोट र डिस्पोजेबल पञ्जाहरू प्रयोग गर्नुहोस्।
