भ्याक्सिनिया भाइरस क्यापिङ इन्जाइम
भ्याक्सिनिया भाइरस क्यापिङ इन्जाइम रिकोम्बिनेन्ट ई. कोलाई स्ट्रेनबाट व्युत्पन्न भएको हो जसले भ्याक्सिनिया क्यापिङ इन्जाइमका लागि जीनहरू बोक्छ।यो एकल इन्जाइम दुई सबयूनिटहरू (D1 र D12) मिलेर बनेको छ र यसमा तीनवटा इन्जाइम्याटिक गतिविधिहरू छन् (RNA triphosphatase र guanylyltransferase D1 subunit द्वारा र guanine methyltransferase D12 subunit)।भ्याक्सिनिया भाइरस क्यापिङ इन्जाइम क्याप संरचनाको निर्माणलाई उत्प्रेरित गर्न प्रभावकारी छ, जसले विशेष रूपमा 7-मिथाइलगुआनिलेट क्याप संरचना (m7Gppp, Cap 0) लाई RNA को 5′ छेउमा जोड्न सक्छ।क्याप संरचना (क्याप ०) ले mRNA स्थिरीकरण, यातायात र युकेरियोट्समा अनुवादमा महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छ।एन्जाइमेटिक प्रतिक्रियाद्वारा आरएनए क्यापिङ एक प्रभावकारी र सरल विधि हो जसले इन भिट्रो ट्रान्सक्रिप्शन, ट्रान्सफेक्सन, र माइक्रोइन्जेक्शनको लागि आरएनएको स्थिरता र अनुवादलाई उल्लेखनीय रूपमा सुधार गर्न सक्छ।
अवयवहरू
भ्याक्सिनिया भाइरस क्यापिङ इन्जाइम (10 U/μL)
१० × क्यापिङ बफर
भण्डारण अवस्थाहरू
भण्डारणको लागि -25～- 15℃ (दोहोरिने फ्रिज-थाउ चक्रबाट बच्नुहोस्)
भण्डारण बफर
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,
1mM DTT, 0. 1mm EDTA, 0. 1% ट्राइटन X- 100, 50% ग्लिसरोल।
एकाइ परिभाषा
भ्याक्सिनिया भाइरस क्यापिङ इन्जाइमको एक एकाइलाई 10pmol GTP को 80nt ट्रान्सक्रिप्टमा 1 घण्टामा 37°C मा समावेश गर्न आवश्यक इन्जाइमको मात्राको रूपमा परिभाषित गरिएको छ।
गुणस्तर नियन्त्रण
Exonuclease:भ्याक्सिनिया भाइरस क्यापिङ इन्जाइमको 10U 1μg λ-Hind III डाइजेस्ट DNA को 37 ℃ मा 16 घण्टाको लागि एगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा निर्धारण गरिए अनुसार कुनै गिरावट उत्पन्न गर्दैन।
इन्डोन्यूक्लिज:भ्याक्सिनिया भाइरस क्यापिङ इन्जाइमको 10U को 1μg λDNA 37 ℃ मा 16 घण्टाको लागि एगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा निर्धारित गरिए अनुसार कुनै गिरावट उत्पन्न गर्दैन।
निकसे:भ्याक्सिनिया भाइरस क्यापिङ इन्जाइमको 10U 1 μg pBR322 को साथ 37 ℃ मा 16 घण्टाको लागि एगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा निर्धारण गरिए अनुसार कुनै गिरावट उत्पन्न गर्दैन।
RNase:भ्याक्सिनिया भाइरस क्यापिङ इन्जाइमको 10U 1.6μg MS2 RNA को साथ 37 ℃ मा 4 घण्टाको लागि एगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा निर्धारण गरे अनुसार कुनै गिरावट उत्पन्न गर्दैन।
1.कोलाई डीएनए:भ्याक्सिनिया भाइरस क्यापिङ इन्जाइमको 10U E. coli 16S rRNA लोकसका लागि विशेष प्राइमरहरू सहित TaqMan qPCR प्रयोग गरेर E. coli genomic DNA को उपस्थितिको लागि जाँच गरिन्छ।ई. कोलाई जीनोमिक डीएनए प्रदूषण ≤1 ई. कोलाई जीनोम हो।
2.ब्याक्टेरियल इन्डोटोक्सिन: LAL-परीक्षण, चिनियाँ फार्माकोपिया IV 2020 संस्करण अनुसार, जेल सीमा परीक्षण विधि, सामान्य नियम (1143)।ब्याक्टेरियल एन्डोटक्सिन सामग्री ≤10 EU/mg हुनुपर्छ।
प्रतिक्रिया प्रणाली र सर्तहरू
1. क्यापिङ प्रोटोकल (प्रतिक्रिया भोल्युम: 20 μL)
यो प्रक्रिया 10μg RNA (≥100 nt) को क्यापिङ प्रतिक्रियामा लागू हुन्छ र यसलाई प्रयोगात्मक माग अनुसार मापन गर्न सकिन्छ।
I) 10μg RNA र Nuclease-free H2O लाई 1.5 ml माइक्रोफ्यूज ट्यूबमा 15.0 μL को अन्तिम मात्रामा मिलाउनुहोस्।*१०×क्यापिङ बफर: ०.५ एम ट्रिस-एचसीएल, ५० एमएम केसीएल, १० एमएम एमजीसीएल२, १० एमएम डीटीटी, (२५℃, पीएच ८.०)
2) 5 मिनेटको लागि 65 डिग्री सेल्सियसमा तातो गर्नुहोस् र त्यसपछि 5 मिनेटको लागि आइस बाथ गर्नुहोस्।
3) निर्दिष्ट क्रममा निम्न अवयवहरू थप्नुहोस्
| Cप्रतियोगी | Vओलुम |
| विकृत RNA (≤10μg, length≥100 nt) | १५ μL |
| १०×क्यापिङ बफर* | २ μL |
| GTP (१० एमएम) | १ μL |
| SAM (2 mM) | १ μL |
| भ्याक्सिनिया भाइरस क्यापिङ इन्जाइम (10U/μL) | १ μL |
*१०×क्यापिङ बफर: ०.५ एम ट्रिस-एचसीएल, ५० एमएम केसीएल, १० एमएम एमजीसीएल२, १० एमएम डीटीटी, (२५℃, pH8.0)
4) 37°C मा 30 मिनेटको लागि इन्क्युबेट गर्नुहोस्, RNA अब क्याप गरिएको छ र डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगहरूको लागि तयार छ।
2. 5′ टर्मिनल लेबलिङ प्रतिक्रिया (प्रतिक्रिया मात्रा: 20 μL)
यो प्रोटोकल 5´ ट्राइफोस्फेट भएको RNA लेबल गर्न डिजाइन गरिएको हो र यसलाई माग अनुसार मापन गर्न सकिन्छ।लेबल समावेश को दक्षता RNA को मोलर अनुपात द्वारा प्रभावित हुनेछ: GTP, साथै RNA नमूनाहरूमा GTP सामग्री।
1) 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूबमा 14.0 μL को अन्तिम मात्रामा RNA र Nuclease-free H2O को उपयुक्त मात्रा मिलाउनुहोस्।
2) 5 मिनेटको लागि 65 डिग्री सेल्सियसमा तातो गर्नुहोस् र त्यसपछि 5 मिनेटको लागि आइस बाथ गर्नुहोस्।
3) निर्दिष्ट क्रममा निम्न अवयवहरू थप्नुहोस्।
| Cप्रतियोगी | Vओलुम |
| विकृत आरएनए | 14 μL |
| १० × क्यापिङ बफर | २ μL |
| GTP मिक्स** | २ μL |
| SAM (2 mM) | १ μL |
| भ्याक्सिनिया भाइरस क्यापिङ इन्जाइम (10U/μL) | १ μL |
** GTP MIX ले GTP र मार्करहरूको सानो संख्यालाई जनाउँछ।GTP को एकाग्रता को लागी, सन्दर्भ गर्नुहोस्नोट 3 मा।
4) 37°C मा 30 मिनेटको लागि इन्क्युबेट गर्नुहोस्, RNA 5′ अन्त अब लेबल गरिएको छ र डाउनस्ट्रीमको लागि तयार छ
अनुप्रयोगहरू
1. क्यापिङ mRNA पहिले अनुवाद asses/in vitro अनुवाद
2. mRNA को 5´ अन्त्य लेबल गर्दै
प्रयोगमा नोटहरू
1.भ्याक्सिनिया क्यापिङ इन्जाइमसँग इन्क्युबेशन अघि आरएनएको समाधानलाई तताउँदा ट्रान्सक्रिप्टको 5'छेउमा रहेको माध्यमिक संरचना हटाउँछ।ज्ञात अत्यधिक संरचित 5'एंडहरू भएका ट्रान्सक्रिप्टहरूको लागि 60 मिनेटमा समय विस्तार गर्नुहोस्।
2. क्यापिङ प्रतिक्रियाहरूको लागि प्रयोग गरिएको आरएनए प्रयोग गर्नु अघि शुद्ध हुनुपर्छ र न्यूक्लिज-रहित पानीमा निलम्बन गर्नुपर्छ।EDTA उपस्थित हुनु हुँदैन र समाधान नुन मुक्त हुनुपर्छ।
3. 5´ अन्त्य लेबल गर्नको लागि, कुल GTP एकाग्रता प्रतिक्रियामा mRNA को मोलर एकाग्रताको लगभग 1-3 गुणा हुनुपर्छ।
4. प्रतिक्रिया प्रणाली को मात्रा वास्तविक अनुसार मापन वा तल मापन गर्न सकिन्छ।
