PNGase F
Peptide-N-Glycosidase F (PNGase F) ग्लाइकोप्रोटिनहरूबाट लगभग सबै एन-लिंक गरिएका ओलिगोसाकराइडहरू हटाउनको लागि सबैभन्दा प्रभावकारी इन्जाइमेटिक विधि हो।PNGase F एक एमिडेस हो, जुन N-linked glycoproteins बाट उच्च mannose, हाइब्रिड, र जटिल oligosaccharides को भित्री सबैभन्दा GlcNAc र asparagine अवशेषहरू बीच क्लिभ हुन्छ।
आवेदन
यो इन्जाइम प्रोटिनबाट कार्बोहाइड्रेट अवशेष हटाउन उपयोगी छ।
तयारी र विनिर्देश
| उपस्थिति | रंगहीन तरल पदार्थ |
| प्रोटिन शुद्धता | ≥95% (SDS-PAGE बाट) |
| गतिविधि | ≥500,000 U/mL |
| Exoglycosidase | कुनै गतिविधि पत्ता लगाउन सकिएन (ND) |
| Endoglycosidase F1 | ND |
| Endoglycosidase F2 | ND |
| Endoglycosidase F3 | ND |
| Endoglycosidase H | ND |
| प्रोटीज | ND |
गुणहरू
| EC नम्बर | ३.५.१.५२(सूक्ष्मजीवबाट पुनः संयोजक) |
| आणविक वजन | ३५ kDa (SDS-PAGE) |
| आइसोइलेक्ट्रिक बिन्दु | ८. १४ |
| इष्टतम pH | ७.०-८.० |
| इष्टतम तापमान | ६५ डिग्री सेल्सियस |
| सब्सट्रेट विशिष्टता | GlcNAc र asparagine अवशेषहरू बीचको ग्लाइकोसिडिक बन्ड क्लिभ गर्दै चित्र। |
| पहिचान साइटहरू | α1-3 फ्युकोज समावेश नभएसम्म एन-लिंक गरिएको ग्लाइकान्स चित्र २ |
| सक्रियकर्ताहरू | DTT |
| अवरोधक | SDS |
| भण्डारण तापमान | -25 ~ -15 ℃ |
| गर्मी निष्क्रियता | 1µL PNGase F भएको 20µL प्रतिक्रिया मिश्रण 75 °C मा 10 मिनेटको लागि इन्क्युबेशनद्वारा निष्क्रिय हुन्छ। |
चित्र 1 PNGase F को सब्सट्रेट विशिष्टता
चित्र 2 पहिचान PNGase F को सिट।
जब आन्तरिक GlcNAc अवशेषहरू α1-3 फ्युकोजसँग जोडिएको हुन्छ, PNGase F ले ग्लाइकोप्रोटिनहरूबाट N-linked oligosaccharides हटाउन सक्दैन।यो परिमार्जन बोटबिरुवा र केही कीरा ग्लाइकोप्रोटिनहरूमा सामान्य छ।
Cघटकहरू
|
| अवयवहरू | एकाग्रता |
| 1 | PNGase F | ५० μl |
| 2 | 10 × ग्लाइकोप्रोटीन डिनेचरिङ बफर | 1000 μl |
| 3 | १० × ग्लाइकोबफर २ | 1000 μl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 μl |
एकाइ परिभाषा
एक एकाइ(U) लाई 10 μL को कुल प्रतिक्रिया मात्रामा 37°C मा 1 घण्टामा 10 µg विकृत RNase B बाट कार्बोहाइड्रेटको 95% हटाउन आवश्यक इन्जाइमको मात्राको रूपमा परिभाषित गरिएको छ।
प्रतिक्रिया अवस्थाहरू
1. 1-20 µg ग्लाइकोप्रोटिनलाई विआयनीकृत पानीमा घोलाउनुहोस्, 1 µl 10×Glycoprotein Denaturing Buffer र H2O (यदि आवश्यक भएमा) थप्नुहोस् 10 µl कुल प्रतिक्रिया मात्रा बनाउन।
2.10 मिनेटको लागि 100 डिग्री सेल्सियसमा इन्क्यूबेट गर्नुहोस्, यसलाई बरफमा चिसो गर्नुहोस्।
3.2 μl 10×GlycoBuffer 2, 2 μl 10% NP-40 थप्नुहोस् र मिश्रण गर्नुहोस्।
4.1-2 μl PNGase F र H थप्नुहोस्2O (यदि आवश्यक भएमा) 20 μl कुल प्रतिक्रिया भोल्युम र मिश्रण बनाउन।
5.60 मिनेटको लागि 37 डिग्री सेल्सियसमा प्रतिक्रिया इन्क्युबेट गर्नुहोस्।
6.SDS-PAGE विश्लेषण वा HPLC विश्लेषणको लागि।
