mRNA Cap2'-O-Methyltransferase

mRNA Cap 2´ -O-methyltransferase खोप mRNA क्याप 2 ´-O-Methyltransferase को लागि जीन बोक्ने पुन: संयोजक ई. कोलाई स्ट्रेनबाट व्युत्पन्न गरिएको थियो।यो इन्जाइमले RNA को 5' अन्तमा टोपी संरचनाको छेउमा रहेको पहिलो न्यूक्लियोटाइडको 2´-O स्थितिमा मिथाइल समूह थप्छ। इन्जाइमले मिथाइल क्याप्ड आरएनए (क्याप) मा मिथाइल दाताको रूपमा S-adenosylmethionine (SAM) लाई प्रयोग गर्छ। -0) क्याप-1 संरचनाको परिणामस्वरूप।

Cap1 संरचनाले ट्रान्सफेक्सन र माइक्रोइन्जेक्सन प्रयोगहरूमा mRNA को अभिव्यक्ति सुधार गर्दै अनुवाद दक्षता बढाउन सक्छ। यो इन्जाइमलाई विशेष रूपमा सब्सट्रेटको रूपमा m7GpppN क्याप भएको RNA चाहिन्छ।यसले 5´ अन्त्यमा pN, ppN, pppN वा GpppN सँग RNA प्रयोग गर्न सक्दैन।क्याप गरिएको आरएनए क्याप एनालग प्रयोग गरेर इन भिट्रो ट्रान्सक्रिप्शन मार्फत वा भ्याक्सिनिया क्यापिङ इन्जाइम प्रयोग गरेर इन्जाइम्याटिक क्यापिङ मार्फत तयार गर्न सकिन्छ।

अवयवहरू

mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase (50U/μL)

10 × क्यापिङ प्रतिक्रिया बफर

भण्डारण

-25 ～- 15 ℃ भण्डारणको लागि （ दोहोरिने फ्रिज-थव चक्रबाट बच्नुहोस्）

भण्डारण बफर

20 mM Tris-HCl（pH 8.0，25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% ग्लिसरोल।

एकाइ परिभाषा

एक एकाइलाई 37 डिग्री सेल्सियसमा 1 घण्टामा 80 nt क्याप गरिएको RNA ट्रान्सक्रिप्टको 10 pmoles methylate गर्न आवश्यक इन्जाइमको मात्राको रूपमा परिभाषित गरिएको छ।

गुणस्तर नियन्त्रण परीक्षणहरू

Exonuclease:50U को mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase 1μg λ-Hind III डाइजेस्ट DNA को 37 ℃ मा 16 घण्टाको लागि एगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा निर्धारण गरे अनुसार कुनै गिरावट उत्पन्न गर्दैन।

इन्डोन्यूक्लिज: mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase को 50 U को 1 μg λDNA संग 37℃ मा 16 घण्टाको लागि एगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा निर्धारण गरिए अनुसार कुनै गिरावट उत्पन्न गर्दैन।

निकसे: mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase को 50U 1μg pBR322 को साथ 37 ℃ मा 16 घण्टाको लागि एगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा निर्धारण गरिए अनुसार कुनै गिरावट उत्पन्न गर्दैन।

RNase: 50U को mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase 1.6μg MS2 RNA सँग 4 घण्टाको लागि 37 ℃ मा एगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा निर्धारण गरिए अनुसार कुनै गिरावट उत्पन्न गर्दैन।

E. कोलाई DNA: mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase को 50U को उपस्थितिको लागि जाँच गरिएको छ।E. कोलाई TaqMan qPCR प्रयोग गरेर जीनोमिक DNA को लागि विशेष प्राइमरहरूE. कोलाई 16S rRNA लोकस।दE. कोलाई जीनोमिक डीएनए प्रदूषण = 1E. कोलाई जीनोम।

ब्याक्टेरियल एन्डोटोक्सिन: LAL-परीक्षण, चिनियाँ फार्माकोपिया IV 2020 संस्करण अनुसार, जेल सीमा परीक्षण विधि, सामान्य नियम (1143)।ब्याक्टेरियल एन्डोटक्सिन सामग्री = 10 EU/mg हुनुपर्छ।

प्रतिक्रिया प्रणाली र सर्तहरू

1. 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूबमा 16.0 μL को अन्तिम मात्रामा क्याप्ड RNA र RNase-रहित H2O को उपयुक्त मात्रा मिलाउनुहोस्।

2. 5 मिनेटको लागि 65 डिग्री सेल्सियसमा तातो गर्नुहोस् र त्यसपछि 5 मिनेटको लागि आइस-बाथ गर्नुहोस्।

3. निर्दिष्ट क्रममा निम्न अवयवहरू थप्नुहोस् (क्याप्ड आरएनएको मेथिलेसनको लागि

10 भन्दा कम

*१०× क्यापिङ रियाक्सन बफर : ५०० मिमी Tris-HCl(pH 8.0, 25℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、10 mM DTT।

4. 1 घण्टाको लागि 37 ℃ मा इन्क्युबेशन गर्नुहोस् (200 nt भन्दा कम लक्ष्य टुक्राको लागि 2 घण्टा इन्क्युबेशन सिफारिस गरिन्छ)।

अनुप्रयोगहरू

माइक्रोइन्जेक्शन र ट्रान्सफेक्सन प्रयोगहरूको समयमा mRNA अभिव्यक्ति सुधार गर्न।

प्रयोगमा नोटहरू

1. प्रतिक्रिया गर्नु अघि, आरएनए शुद्ध हुनुपर्छ र न्यूक्लिज-रहित पानीमा घुलनशील हुनुपर्छ, सबै समाधानहरूमा कुनै पनि EDTA र आयनहरू हुनु हुँदैन।

2. ट्रान्सक्रिप्टको 5'छेउमा रहेको माध्यमिक संरचना हटाउन प्रतिक्रिया हुनु अघि 5 मिनेटको लागि नमूना RNA 65℃ मा तताउन सिफारिस गरिन्छ।यो जटिल 5 ´ - टर्मिनल संरचनाको लागि 10 मिनेटमा विस्तार गर्न सकिन्छ।