डबल-स्ट्र्यान्ड RNA (dsRNA) ELISA KIT

यो किट एक इन्जाइम-लिंक गरिएको इम्युनोसोर्बेन्ट एसे (ELISA) बायोटिन-स्ट्रेप्टाभिडिन प्रणालीको साथ युग्मन हो, 60 आधार जोडी (bp) भन्दा माथिको लम्बाइको dsRNA को मात्रात्मक मापनको लागि, क्रमको पर्वाह नगरी।प्लेटलाई एन्टी-डीएसआरएनए एन्टिबडीले पूर्व-लेपित गरिएको छ।नमूनामा उपस्थित dsRNA थपिन्छ र इनारहरूमा लेपित एन्टिबडीहरूमा बाँधिन्छ।र त्यसपछि बायोटिनिलेटेड एन्टि-dsRNA एन्टिबडी थपिन्छ र नमूनामा dsRNA मा बाँधिन्छ।धोएपछि, एचआरपी-स्ट्रेप्टाभिडिन थपिन्छ र बायोटिनिलेटेड एन्टि-डीएसआरएनए एन्टिबडीसँग जोडिन्छ।इन्क्युबेशन पछि अनबाउन्ड HRP-Streptavidin धोइन्छ।त्यसपछि TMB सब्सट्रेट समाधान थपिन्छ र HRP द्वारा उत्प्रेरित गरी नीलो रंगको उत्पादन उत्पादन गरिन्छ जुन एसिडिक स्टप समाधान थपेपछि पहेंलोमा परिवर्तन हुन्छ।पहेंलोको घनत्व प्लेटमा कैद गरिएको dsRNA को लक्ष्य मात्रासँग समानुपातिक हुन्छ।अवशोषण 450 एनएम मा मापन गरिन्छ।

आवेदन

यो किट अवशिष्ट dsRNA को मात्रात्मक मापनको लागि हो।

किट अवयवहरू

भण्डारण र स्थिरता

1. प्रयोग नगरिएको किटको लागि: सम्पूर्ण किट शेल्फ लाइफमा 2 ~ 8℃ मा भण्डारण गर्न सकिन्छ।भण्डारण स्थिरताको लागि बलियो प्रकाश बेवास्ता गर्नुपर्छ।

2. प्रयोग गरिएको किटको लागि: एक पटक माइक्रोप्लेट खोलिसकेपछि, कृपया प्रयोग नगरिएका इनारहरूलाई प्लेट सीलरले छोप्नुहोस् र डेसिक्यान्ट प्याक भएको पन्नी पाउचमा फर्कनुहोस्, पन्नीको पाउचलाई जिप-सील गर्नुहोस् र प्रयोग पछि सकेसम्म चाँडो 2~8 ℃ मा फर्कनुहोस्।अन्य अभिकर्मकहरू प्रयोग पछि सकेसम्म चाँडो 2 ~ 8 ℃ मा फर्किनु पर्छ।

सामाग्री आवश्यक छ तर आपूर्ति गरिएको छैन

1. 450±10nm फिल्टर भएको माइक्रोप्लेट रिडर (450 र 650 nm तरंगदैर्ध्यमा पत्ता लगाउन सकिन्छ भने राम्रो)।

2. माइक्रोप्लेट शेकर।

3. RNase-रहित टिप्स र सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबहरू।

सञ्चालन फ्लोचार्ट

तपाईंले सुरु गर्नु अघि

1. प्रयोग गर्नु अघि सबै किट घटक र नमूनाहरू कोठाको तापक्रम (18-25 ℃) मा ल्याउनुहोस्।यदि किट एक पटकमा प्रयोग हुने छैन भने, कृपया हालको प्रयोगको लागि स्ट्रिपहरू र अभिकर्मकहरू मात्र निकाल्नुहोस्, र बाँकी स्ट्रिपहरू र अभिकर्मकहरूलाई आवश्यक अवस्थामा छोड्नुहोस्।

2. धुने बफर: 1× धुने बफरको 800mL तयार गर्न 760mL डियोनाइज्ड वा डिस्टिल्ड वाटरको 20x केन्द्रित वाश बफरको 40mL पातलो गर्नुहोस्।

3. मानक: प्रयोग गर्नु अघि स्टक समाधानलाई छोटकरीमा घुमाउनुहोस् वा सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुहोस्।प्रदान गरिएको चार मापदण्डहरूको एकाग्रता 5ng/μL हो।UTP र pUTP dsRNA मापदण्डहरूका लागि, कृपया स्टक समाधानलाई 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL मा STE बफरसँग पातलो गर्नुहोस्।N1-Me-pUTP dsRNA मापदण्डहरूका लागि, कृपया स्टक समाधानलाई 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL मा STE बफरसँग पातलो गर्नुहोस्।5-OMe-UTP dsRNA मानकको लागि, मानक कर्भ कोर्न STE बफरको साथ 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL मा स्टक समाधान पातलो गर्नुहोस्।हामी निम्न चार्टहरूको रूपमा मापदण्डहरू पातलो गर्न सकिन्छ भनेर सिफारिस गर्छौं:

4. बायोटिनिलेटेड पत्ता लगाउने एन्टिबडी र HRP-स्ट्रेप्टाभिडिन काम गर्ने समाधान: प्रयोग गर्नु अघि स्टक समाधानलाई छोटकरीमा घुमाउनुहोस् वा सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुहोस्।पातलो बफर संग काम एकाग्रता मा तिनीहरूलाई पतला।

5. TMB सबस्टेट: नसबंदी टिप्स संग समाधान को आवश्यक खुराक एस्पिरेट गर्नुहोस् र अवशिष्ट घोल फेरि शीशी मा फ्याँक्नुहोस्।TMB सबस्टेट प्रकाशको लागि संवेदनशील छ, TMB सब्सट्रेटलाई लामो समयसम्म प्रकाशमा नदेखाउनुहोस्।

प्रोटोकल प्रयोग गर्दै

1. परखको लागि आवश्यक स्ट्रिपहरूको संख्या निर्धारण गर्नुहोस्।प्रयोगको लागि फ्रेमहरूमा स्ट्रिपहरू घुसाउनुहोस्।यस परखमा प्रयोग नगरिएका बाँकी प्लेट स्ट्रिपहरूलाई डेसिकेन्टले झोलामा पुन: प्याक गर्नुपर्छ।फ्रिज भण्डारणको लागि झोलालाई कडा रूपमा बन्द गर्नुहोस्।

2. उपयुक्त इनारहरूमा मानक, खाली र नमूनाहरूको प्रत्येक 100μL थप्नुहोस्।प्लेट सीलरले छोप्नुहोस्।कोठाको तापक्रममा ५०० आरपीएममा हल्लाउँदै १ घण्टाको लागि इन्क्युबेशन गर्नुहोस्।नमूनाहरू सही परखको लागि उपयुक्त एकाग्रतामा STE बफरसँग पातलो हुनुपर्छ।

3. धुने चरण: समाधान एस्पिरेट गर्नुहोस् र प्रत्येक इनारमा 250μL वाश बफरले धुनुहोस् र यसलाई 30 सेकेन्डसम्म खडा गर्न दिनुहोस्।प्लेटलाई शोषक कागजमा स्न्याप गरेर धुने बफर पूर्ण रूपमा खारेज गर्नुहोस्।पूर्ण रूपमा 4 पटक धुनुहोस्।

4. प्रत्येक इनारमा 100μL biotinylated पत्ता लगाउने एन्टिबडी काम गर्ने समाधान थप्नुहोस्।प्लेट सीलरले छोप्नुहोस्।कोठाको तापक्रममा ५०० आरपीएममा हल्लाउँदै १ घण्टाको लागि इन्क्युबेट गर्नुहोस्।

5. धुने चरण दोहोर्याउनुहोस्।

6. प्रत्येक इनारमा 100μL HRP-streptavidin कार्य गर्ने समाधान थप्नुहोस्।प्लेट सीलरले छोप्नुहोस्।कोठाको तापक्रममा ५०० आरपीएममा हल्लाएर ३० मिनेटसम्म इन्क्युबट गर्नुहोस्।

7. पुन: धुने चरण दोहोर्याउनुहोस्।

8. प्रत्येक इनारमा 100μL TMB सब्सट्रेट समाधान थप्नुहोस्।प्लेट सीलरले छोप्नुहोस्।RT प्रोटेक्ट लाई प्रकाशबाट ३० मिनेटसम्म इन्क्युबेट गर्नुहोस्।सब्सट्रेट समाधान थप्दा तरल निलो हुनेछ।

9. प्रत्येक इनारमा 50μL स्टप समाधान थप्नुहोस्।स्टप समाधान थप्दा तरल पहेंलो हुनेछ।त्यसपछि माइक्रोप्लेट रिडर चलाउनुहोस् र तुरुन्तै 450nm मा मापन सञ्चालन गर्नुहोस्।

परिणामहरूको गणना

1. प्रत्येक मानक, नियन्त्रण, र नमूनाहरूको लागि डुप्लिकेट पठनहरू औसत गर्नुहोस् र औसत शून्य मानक अप्टिकल घनत्व घटाउनुहोस्।ठाडो (Y) अक्षमा अवशोषण र तेर्सो (X) अक्षमा dsRNA एकाग्रताको साथ मानक वक्र निर्माण गर्नुहोस्।

2. यो 5 वा 4 प्यारामिटर गैर-रैखिक फिट मोडेलमा कर्भ विशेषज्ञ 1.3 वा ELISA Calc जस्ता कम्प्युटर-आधारित कर्भ-फिटिंग सफ्टवेयरसँग गणना गर्न सिफारिस गरिन्छ।

प्रदर्शन

1. संवेदनशीलता:

पत्ता लगाउने तल्लो सीमा: ≤ 0.001pg/μL (UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA को लागि), ≤ 0.01pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA को लागि)।

परिमाणको तल्लो सीमा: 0.0156 pg/μL (UTP-, pUTP-dsRNA को लागि), 0.0312 pg/μL (N1-Me-pUTP-dsRNA को लागि), 0.0625 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA को लागि)।

2. सटीक: Intra-Asay को CV ≤10%, Inter-Asay को CV ≤10%

3. रिकभरी: 80% ~ 120%

4.Linearity:0.0156-0.5pg/μL(UTP-,pUTP-dsRNA को लागि)0.0312-1pg/μL(forN1-Me-pUTP dsRNA), 0.0625-1pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA को लागि)।

विचारहरू

1. TMB प्रतिक्रिया तापमान र समय महत्वपूर्ण छ, कृपया तिनीहरूलाई निर्देशन अनुसार कडाईका साथ नियन्त्रण गर्नुहोस्।

2. राम्रो परख पुनरुत्पादन र संवेदनशीलता प्राप्त गर्नको लागि, अतिरिक्त अन-प्रतिक्रिया नगर्ने अभिकर्मकहरू हटाउन प्लेटहरूको उचित धुलाई आवश्यक छ।

3. प्रयोग गर्नु अघि सबै अभिकर्मकहरू राम्ररी मिसाउनु पर्छ र नमूना वा अभिकर्मकहरू थप्दा बम्बलहरूबाट बच्नुपर्दछ।

4. यदि क्रिस्टलहरू केन्द्रित धुने बफर (20x) मा बनेको छ भने, 37 डिग्री सेल्सियस सम्म न्यानो पार्नुहोस् र क्रिस्टलहरू पूर्ण रूपमा विघटन नभएसम्म बिस्तारै मिलाउनुहोस्।

5. सोडियम एजाइड (NaN3) भएको नमूनाहरूको परख नगर्नुहोस्, किनकि यसले HRP गतिविधिलाई नष्ट गर्न सक्छ जसले dsRNA को मात्रा कम अनुमान गर्न सक्छ।

6. परख गर्दा RNase प्रदूषणबाट बच्नुहोस्।

7. मानक/नमूना, पत्ता लगाउने एन्टिबडी र SA-HRP पनि बिना हल्लाई RT मा सञ्चालन गर्न सकिन्छ, तर यसले पत्ता लगाउने संवेदनशीलता एक गुणाले घटाउन सक्छ।यस अवस्थामा, हामी सुझाव दिन्छौं कि UTP र pUTP dsRNA मापदण्डहरू 2pg/μL बाट पातलो हुनुपर्छ, N1-Me-pUTP dsRNA मापदण्डहरू 4pg/μL बाट पातलो हुनुपर्छ र 5-OMe-UTP dsRNA मानकहरू 8pg/μL बाट पातलो हुनुपर्छ।थप रूपमा, कोठाको तापक्रममा ६० मिनेटको लागि HRP-streptavidin कार्य गर्ने समाधान इन्क्युबेट गर्नुहोस्।फ्लास्क शेकर प्रयोग नगर्नुहोस्, किनकि फ्लास्क शेकरले गलत परिणाम ल्याउन सक्छ।

सामान्य परिणाम

1. मानक वक्र डेटा

2. मानक वक्र गणना

3. लाइनर पत्ता लगाउने दायरा: 0.0312- 1pg/μL